Descrever um método que permita separar a proteína n^{\circ} 6 de uma mistura que contenha seis proteínas, sabendo-se que:
a) as proteínas de \mathrm{n}^{\circ} 1,3 e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a 40 \% de saturação;
b) as proteínas de \mathrm{n}^{\circ} 1,2,4 e 6 precipitam pelo etanol gelado;
c) as proteínas de \mathrm{n}^{\circ} 1,3,5 e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a 75 \% de saturação;
d) os pontos isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6,5; o da proteína 2 é 7,2; o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6,3 e o da proteína 5 é 6,8.

Passo 1

O que o problema pede: descrever um método prático que permita separar a proteína número 6 da mistura que contém as seis proteínas, usando as informações fornecidas.
Informações fornecidas (peguei todos estes dados do enunciado):
  • (a) As proteínas de número 1, 3 e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a 40\% de saturação.
  • (b) As proteínas de número 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol gelado.
  • (c) As proteínas de número 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a 75\% de saturação.
  • (d) Pontos isoelétricos:
    • proteínas 1 e 3: pI=6,5;
    • proteína 2: pI=7,2;
    • proteínas 4 e 6: pI=6,3;
    • proteína 5: pI=6,8.
Resumo do objetivo com os dados: preciso ficar com a proteína 6 isolada (ou o mais pura possível) a partir desses comportamentos de precipitação e dos pI.

Passo 2

Ideia geral de estratégia — raciocínio lógico curto (sem ainda executar):
  • A informação (a) diz que 1, 3 e 5 saem da solução quando se atinge 40\% de saturação de (NH_4)_2SO_4. Quem precipita a 40\% certamente também precipita a níveis maiores, mas quem não precipita a 40\% pode precipitar mais tarde ao aumentar a saturação.
  • A informação (c) mostra que, ao atingir 75\%, precipitam 1, 3, 5 e 6. Como 1,3,5 já saíram no passo de 40\%, o material que resta e que precipitará ao subir de 40\% para 75\% será a proteína 6 (entre as que sobraram).
  • Assim, a sequência “primeiro 40\%, separar pellet; depois aumentar para 75\% e recolher o novo pellet” é uma estratégia direta de fracionamento que deve isolar a proteína 6, porque:
    • após o passo a 40\% o sobrenadante contém 2,4,6 (já que 1,3,5 precipitaram);
    • ao ir a 75\% desse sobrenadante só 6 precipita (pela informação (c), 2 e 4 não precipitam a 75\% segundo o enunciado).
Vou agora explicar por que esse raciocínio funciona em termos físicos/experimentais.

Passo 3

Conceito didático: “salting out” com sulfato de amônio (princípio usado)
  • O sulfato de amônio (NH_4)_2SO_4 é um sal fortemente hidratante. Ao adicioná-lo, as moléculas de água ficam “presas” ao sal, diminuindo a solvatação das proteínas. Proteínas menos solúveis perdem solvatação e agregam-se, formando precipitado.
  • Cada proteína tem uma solubilidade característica em função da concentração de sal. Dizemos que ela “precipita” a uma dada percentagem de saturação quando, ao alcançar essa concentração, ela forma um pellet.
  • Importante: se uma proteína precipita a uma saturação mais baixa (ex.: 40\%), ela permanecerá precipitada quando a saturação subir para 75\%. Por isso o fracionamento por etapas (primeiro 40\%, retirar pellet; depois ir a 75\%) permite separar grupos de proteínas por faixa de solubilidade.
  • Experimentalmente escolhe-se temperatura baixa (ex.: 4^\circC) e pH confortável (aquele em que proteínas não são desnaturadas) para evitar desnaturação durante a adição do sal.

Passo 4

Procedimento experimental detalhado e passo a passo (como fazer “na prova” ou em laboratório):
  1. Preparação inicial: mantenha a amostra fria ( \sim4^\circC), ajuste o tampão a um pH apropriado onde as proteínas estejam estáveis (p.ex. pH neutro se nada mais for dito). Agitar suavemente durante adições.
  2. Primeiro fracionamento — atingir 40\% de saturação de (NH_4)_2SO_4:
    • Adicionar gradualmente (NH_4)_2SO_4 sólido (ou solução concentrada) até alcançar 40\% de saturação, mantendo temperatura baixa e agitação. (Em prática usa-se tabelas que dão a massa de sal necessária para atingir \% de saturação à temperatura escolhida.)
    • Deixar sistema em equilíbrio por alguns minutos e centrifugar.
    • O pellet terá as proteínas 1, 3 e 5 (pela informação (a)). Guardar esse pellet (pode-se rescindir as proteínas se interessar) e descartar ou reservar conforme objetivo.
    • O sobrenadante agora contém as proteínas 2, 4 e 6.
  3. Segundo fracionamento — aumentar para 75\%:
    • Ao sobrenadante do passo anterior, adicionar mais (NH_4)_2SO_4 até atingir 75\% de saturação (novamente em frio, agitação).
    • Centrifugar. O novo pellet conterá as proteínas que precipitam até 75\% mas que não tinham precipitado a 40\%. Pelo enunciado (c), entre as que restavam (2,4,6) apenas a proteína 6 precipita nesse intervalo; portanto esse pellet será essencialmente a proteína 6.
  4. Recuperação e limpeza:
    • Dissolver suavemente o pellet contendo a proteína 6 em tampão apropriado (baixo sal).
    • Remover o excesso de sal usando diálise contra tampão adequado ou por filtração em gel desalting (troca de tampão). Isso é necessário porque (NH_4)_2SO_4 em alta concentração atrapalha análises e atividades enzimáticas.
  5. Verificação de pureza:
    • Verificar a pureza por SDS-PAGE ou eletroforese analítica. Se houver impurezas residuais, pode-se aplicar etapas adicionais (ex.: cromatografia por troca iônica, por afinidade ou gel-filtração) para polir a amostra.

Passo 5

Por que não usar imediatamente etanol ou pI para separar 6?
  • Etanol gelado (informação (b)) precipita 1, 2, 4 e 6 juntos. Portanto, se começar por etanol, a proteína 6 viria misturada com 1,2,4 e não seria uma boa primeira separação seletiva. Poder-se-ia usar etanol em outra estratégia, mas o fracionamento por sulfato de amônio já nos dá uma solução direta e mais seletiva para 6.
  • Sobre usar o ponto isoelétrico ( pI): proteínas 4 e 6 têm o mesmo pI=6,3. Ajustar o pH até 6,3 precipitaria ambas (isoelétricas), logo não separaria 4 de 6. Por isso a rota por pI não é útil para distinguir 4 e 6; felizmente a informação de solubilidade em (NH_4)_2SO_4 resolve isso, porque 4 não precipita a 75\% enquanto 6 sim.

Passo 6

Notas práticas e cuidados (para não se ferrar na prova nem no laboratório):
  • Trabalhar sempre em frio para evitar desnaturação.
  • Adicionar sal lentamente e homogeneizar para evitar precipitação local e desnaturação irreversível.
  • Usar tabela/guia para calcular massa de (NH_4)_2SO_4 necessária para atingir exatamente 40\% e 75\% (o enunciado assume que isso é conhecido).
  • Dialisar para remover sal e evitar interferência em etapas seguintes.
  • Conferir pureza por métodos analíticos e, se necessário, aplicar cromatografia para “polir” a proteína 6.

Resposta

  1. Adicionar (NH_4)_2SO_4 até 40\% de saturação, centrifugar e remover o pellet (contendo as proteínas 1, 3 e 5).
  2. Ao sobrenadante, aumentar a saturação de (NH_4)_2SO_4 até 75\%, centrifugar; o pellet obtido corresponderá à proteína 6.
  3. Redissolver o pellet, remover o sal por diálise ou desalting e verificar/purificar adicionalmente por SDS-PAGE e, se necessário, cromatografia.

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