Descrever um método que permita separar a proteína
de uma mistura que contenha seis proteínas, sabendo-se que:
a) as proteínas de
e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a
de saturação;
b) as proteínas de
e 6 precipitam pelo etanol gelado;
c) as proteínas de
e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a
de saturação;
d) os pontos isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6,5; o da proteína 2 é 7,2; o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6,3 e o da proteína 5 é 6,8.
a) as proteínas de
b) as proteínas de
c) as proteínas de
d) os pontos isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6,5; o da proteína 2 é 7,2; o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6,3 e o da proteína 5 é 6,8.
Passo 1
O que o problema pede: descrever um método prático que permita separar a proteína número 6 da mistura que contém as seis proteínas, usando as informações fornecidas.
Informações fornecidas (peguei todos estes dados do enunciado):
- (a) As proteínas de número 1, 3 e 5 precipitam pelo sulfato de amônio a
de saturação. - (b) As proteínas de número 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol gelado.
- (c) As proteínas de número 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo sulfato de amônio a
de saturação. - (d) Pontos isoelétricos:
- proteínas 1 e 3:
; - proteína 2:
; - proteínas 4 e 6:
; - proteína 5:
.
- proteínas 1 e 3:
Resumo do objetivo com os dados: preciso ficar com a proteína 6 isolada (ou o mais pura possível) a partir desses comportamentos de precipitação e dos
.
Passo 2
Ideia geral de estratégia — raciocínio lógico curto (sem ainda executar):
- A informação (a) diz que 1, 3 e 5 saem da solução quando se atinge
de saturação de . Quem precipita a certamente também precipita a níveis maiores, mas quem não precipita a pode precipitar mais tarde ao aumentar a saturação. - A informação (c) mostra que, ao atingir
, precipitam 1, 3, 5 e 6. Como 1,3,5 já saíram no passo de , o material que resta e que precipitará ao subir de para será a proteína 6 (entre as que sobraram). - Assim, a sequência “primeiro
, separar pellet; depois aumentar para e recolher o novo pellet” é uma estratégia direta de fracionamento que deve isolar a proteína 6, porque: - após o passo a
o sobrenadante contém 2,4,6 (já que 1,3,5 precipitaram); - ao ir a
desse sobrenadante só 6 precipita (pela informação (c), 2 e 4 não precipitam a segundo o enunciado).
- após o passo a
Vou agora explicar por que esse raciocínio funciona em termos físicos/experimentais.
Passo 3
Conceito didático: “salting out” com sulfato de amônio (princípio usado)
- O sulfato de amônio
é um sal fortemente hidratante. Ao adicioná-lo, as moléculas de água ficam “presas” ao sal, diminuindo a solvatação das proteínas. Proteínas menos solúveis perdem solvatação e agregam-se, formando precipitado. - Cada proteína tem uma solubilidade característica em função da concentração de sal. Dizemos que ela “precipita” a uma dada percentagem de saturação quando, ao alcançar essa concentração, ela forma um pellet.
- Importante: se uma proteína precipita a uma saturação mais baixa (ex.:
), ela permanecerá precipitada quando a saturação subir para . Por isso o fracionamento por etapas (primeiro , retirar pellet; depois ir a ) permite separar grupos de proteínas por faixa de solubilidade. - Experimentalmente escolhe-se temperatura baixa (ex.:
C) e pH confortável (aquele em que proteínas não são desnaturadas) para evitar desnaturação durante a adição do sal.
Passo 4
Procedimento experimental detalhado e passo a passo (como fazer “na prova” ou em laboratório):
- Preparação inicial: mantenha a amostra fria (
C), ajuste o tampão a um pH apropriado onde as proteínas estejam estáveis (p.ex. pH neutro se nada mais for dito). Agitar suavemente durante adições. - Primeiro fracionamento — atingir
de saturação de : - Adicionar gradualmente
sólido (ou solução concentrada) até alcançar de saturação, mantendo temperatura baixa e agitação. (Em prática usa-se tabelas que dão a massa de sal necessária para atingir de saturação à temperatura escolhida.) - Deixar sistema em equilíbrio por alguns minutos e centrifugar.
- O pellet terá as proteínas 1, 3 e 5 (pela informação (a)). Guardar esse pellet (pode-se rescindir as proteínas se interessar) e descartar ou reservar conforme objetivo.
- O sobrenadante agora contém as proteínas 2, 4 e 6.
- Adicionar gradualmente
- Segundo fracionamento — aumentar para
: - Ao sobrenadante do passo anterior, adicionar mais
até atingir de saturação (novamente em frio, agitação). - Centrifugar. O novo pellet conterá as proteínas que precipitam até
mas que não tinham precipitado a . Pelo enunciado (c), entre as que restavam (2,4,6) apenas a proteína 6 precipita nesse intervalo; portanto esse pellet será essencialmente a proteína 6.
- Ao sobrenadante do passo anterior, adicionar mais
- Recuperação e limpeza:
- Dissolver suavemente o pellet contendo a proteína 6 em tampão apropriado (baixo sal).
- Remover o excesso de sal usando diálise contra tampão adequado ou por filtração em gel desalting (troca de tampão). Isso é necessário porque
em alta concentração atrapalha análises e atividades enzimáticas.
- Verificação de pureza:
- Verificar a pureza por SDS-PAGE ou eletroforese analítica. Se houver impurezas residuais, pode-se aplicar etapas adicionais (ex.: cromatografia por troca iônica, por afinidade ou gel-filtração) para polir a amostra.
Passo 5
Por que não usar imediatamente etanol ou pI para separar 6?
- Etanol gelado (informação (b)) precipita 1, 2, 4 e 6 juntos. Portanto, se começar por etanol, a proteína 6 viria misturada com 1,2,4 e não seria uma boa primeira separação seletiva. Poder-se-ia usar etanol em outra estratégia, mas o fracionamento por sulfato de amônio já nos dá uma solução direta e mais seletiva para 6.
- Sobre usar o ponto isoelétrico (
): proteínas 4 e 6 têm o mesmo . Ajustar o pH até precipitaria ambas (isoelétricas), logo não separaria 4 de 6. Por isso a rota por não é útil para distinguir 4 e 6; felizmente a informação de solubilidade em resolve isso, porque 4 não precipita a enquanto 6 sim.
Passo 6
Notas práticas e cuidados (para não se ferrar na prova nem no laboratório):
- Trabalhar sempre em frio para evitar desnaturação.
- Adicionar sal lentamente e homogeneizar para evitar precipitação local e desnaturação irreversível.
- Usar tabela/guia para calcular massa de
necessária para atingir exatamente e (o enunciado assume que isso é conhecido). - Dialisar para remover sal e evitar interferência em etapas seguintes.
- Conferir pureza por métodos analíticos e, se necessário, aplicar cromatografia para “polir” a proteína 6.
Resposta
- Adicionar
até de saturação, centrifugar e remover o pellet (contendo as proteínas 1, 3 e 5). - Ao sobrenadante, aumentar a saturação de
até , centrifugar; o pellet obtido corresponderá à proteína 6. - Redissolver o pellet, remover o sal por diálise ou desalting e verificar/purificar adicionalmente por SDS-PAGE e, se necessário, cromatografia.