Como funciona o método de contagem de bactérias por filtragem?

Passo 1

O que você pediu: explicar, passo a passo e de forma didática, como funciona o método de contagem de bactérias por filtragem.
Informações disponíveis: nenhum dado experimental específico (volume, número de colónias, tipo de amostra). Vou cobrir desde a ideia-princípio até cálculo, controles, erros comuns e dicas para a prova.

Passo 2

Princípio básico (a ideia que você precisa entender antes de qualquer coisa).
  • Quando se filtra um volume conhecido de líquido por uma membrana com poros pequenos, as bactérias ficam retidas na superfície da membrana.
  • Se a membrana for colocada sobre um meio de cultura adequado e incubada, cada célula viável (ou pequeno aglomerado) crescerá formando uma colónia visível.
  • Contando as colónias e sabendo o volume filtrado (e as diluições feitas), obtém-se a concentração de bactérias viáveis expressa em unidades formadoras de colónia por mililitro ( \mathrm{CFU/mL}).
    Essa é a lógica: “cada colónia = uma célula viável (aproximadamente)”.

Passo 3

Materiais e parâmetros importantes (o que vai fazer diferença prática e na prova).
  • Membrana de filtração: poros típicos \,0{,}45\,\mu\mathrm{m} (uso geral) ou \,0{,}22\,\mu\mathrm{m} (para reter bactérias pequenas). Escreva esses números na cabeça.
  • Montagem de filtração a vácuo (funil, suporte, frasco coletor) ou sistema de seringa com cápsula filtrante estéril.
  • Meios de cultura apropriados (por exemplo, ágar nutritivo, ágar seletivo conforme a espécie que se deseja contar).
  • Incubador com temperatura controlada (por exemplo 35^\circ\mathrm{C} a 37^\circ\mathrm{C} para muitos patógenos; 20^\circ\mathrm{C} a 25^\circ\mathrm{C} para águas ambientais, dependendo do protocolo).
  • Pinça estéril, luvas, estufa de secagem/esterilização, controles (branco).
  • Volumes: filtra-se um volume conhecido V (em mL). Se houver muitas bactérias faz-se diluições seriais antes de filtrar.

Passo 4

Protocolo passo a passo prático (o procedimento “na bancada”).
  1. Preparar tudo estéril e perto do fluxo laminar (se houver). Colocar placas de ágar prontas e etiquetadas.
  2. Se a amostra estiver muito concentrada, preparar diluições seriais em solução salina estéril (por exemplo diluições 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, etc.). Anotar exatamente o fator de diluição.
  3. Montar o dispositivo de filtração e colocar uma membrana estéril no suporte.
  4. Filtrar um volume conhecido V da amostra (ou da diluição escolhida). Anotar V em mL e o fator de diluição DF (por exemplo, DF=10^{3} para diluição 10^{-3}).
  5. Remover a membrana com pinça estéril e colocá-la com cuidado sobre a placa de ágar (ou colocar a membrana sobre o meio com a face que reteve as bactérias voltada para o ágar, conforme protocolo). Selar a placa parcialmente para evitar contaminação.
  6. Incubar na temperatura e tempo apropriados para o organismo alvo.
  7. Após incubação, contar as colónias visíveis sobre a membrana.

Passo 5

Como contar e que números aceitar (regras práticas).
  • Faixa aceitável de contagem: normalmente busca-se placas com contagem “contável”, tipicamente entre 20 e 200 colónias (alguns protocolos usam 25–250). Por que? Menos que 20 é estatisticamente pouco confiável; acima de 200 fica muito denso e pode haver fusão de colónias (subestimação).
  • Se houver muitas colónias, repetir com maior diluição; se houver zero ou pouquíssimas, filtrar maior volume ou usar diluição menor.
  • Contar sempre placas em duplicata ou triplicata quando possível e calcular média.

Passo 6

Fórmula e cálculo (a parte que costuma cair em prova — decora e pratique).
  • Fórmula geral:
\mathrm{CFU/mL} = \dfrac{\text{nº de colónias contadas}}{\text{volume filtrado (mL)}} \times \text{fator de diluição}.ºóçã
  • O “fator de diluição” é o inverso da fração filtrada. Exemplos:
    • Se filtrar amostra sem diluir, \text{fator de diluição}=1çã.
    • Se filtrar 1\\ \text{mL} de uma diluição 10^{-3}, então \text{fator de diluição}=10^{3}çã.
      Exemplo numérico: filtra-se 1{,}0\\ \mathrm{mL} da diluição 10^{-3} e contam-se 120 colónias.
\mathrm{CFU/mL} = \dfrac{120}{1{,}0}\times 10^{3} = 1{,}2\times 10^{5}\\ \mathrm{CFU/mL}.
Outro exemplo: filtra-se 100{,}0\\ \mathrm{mL} da amostra sem diluir e aparecem 3 colónias:
\mathrm{CFU/mL} = \dfrac{3}{100{,}0}\times 1 = 0{,}03\\ \mathrm{CFU/mL}.
  • Detectabilidade: quanto maior o volume filtrado, menor é o limite de detecção. Filtrar 100{,}0\\ \mathrm{mL} permite detectar concentrações muito baixas.

Passo 7

Controles, reprodutibilidade e validade dos resultados.
  • Sempre incluir um controle em branco (filtrar água estéril) para checar contaminação do sistema.
  • Fazer réplicas (duplicatas/triplicatas) de cada diluição e usar a média das contagens aceitáveis.
  • Registrar condições de incubação e meio, porque diferentes meios e tempos afetam o número de colónias visíveis.

Passo 8

Vantagens e limitações (para saber quando usar e o que espera na prova).
Vantagens:
  • Sensível (pode filtrar grandes volumes para encontrar poucos microrganismos).
  • Direto: conta bactérias viáveis que formam colónias.
    Limitações:
  • Só detecta bactérias viáveis que crescem nas condições e no meio usados (não detecta células viáveis não cultiváveis).
  • Aglomeração de células leva a subestimação (um aglomerado → uma colónia).
  • Membranas podem entupir com amostras turvas; então é preciso pré-filtrar ou fazer diluições.
  • Contagem pode ser afetada por bactérias que crescem lentamente ou que necessitam de condições especiais.

Passo 9

Erros comuns e como evitá‑los (truques que salvam nota em prova e experimento).
  • Entupimento da membrana: filtrar volumes menores ou pré-filtrar com poro maior.
  • Contaminação do aparelho: esterilizar antes e usar controles em branco.
  • Incubação em temperatura errada ou tempo insuficiente: seguir protocolos padronizados para o organismo-alvo.
  • Não anotar volumes ou fatores de diluição corretamente: isso quebra todo o cálculo — anote tudo.
  • Contar placas fora da faixa aceitável: use outra diluição com contagem adequada.

Passo 10

Dicas rápidas para prova e para a bancada (motivação e praticidade).
  • Decore a fórmula e pratique pelo menos 2 exemplos (um com diluição, outro sem).
  • Lembre-se: volume em mL, colónias contadas sem unidade, fator de diluição como potência de dez.
  • Na prova, deixe claro qual placa está sendo usada (volume e diluição) ao apresentar o cálculo.
  • Se estiver inseguro, escreva os controles e a faixa contável; isso ajuda a ganhar pontos parciais.

Resposta

Filtrar um volume conhecido por uma membrana que retém as bactérias, incubar a membrana em meio apropriado até formação de colónias, contar as colónias e calcular a concentração por
\mathrm{CFU/mL} = \dfrac{\text{nº de colónias}}{\text{volume filtrado (mL)}} \times \text{fator de diluição}.ºóçã

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