Com base nos métodos de preparação das placas para contagem, descreva os métodos de incorporação em placa e de espalhamento em placa.

Passo 1

O enunciado pede que eu descreva — com base nos métodos de preparação de placas para contagem — dois procedimentos: (1) o método de incorporação em placa e (2) o método de espalhamento em placa.
Informações que já temos (implícitas na pergunta): ambos são usados para quantificar microrganismos viáveis a partir de amostras líquidas ou suspensões, exigem diluições seriadas quando a amostra está concentrada e resultam em colónias que serão contadas para estimar concentração em CFU por mL.

Passo 2

Visão geral curta antes de entrar nos procedimentos:
  • O método de incorporação em placa (pour plate) consiste em misturar uma alíquota da diluição com ágar líquido (resfriado a uma temperatura segura), verter na placa e deixar solidificar; as colónias crescem tanto na superfície quanto embebidas no meio.
  • O método de espalhamento em placa (spread plate) consiste em depositar uma pequena alíquota da diluição sobre a superfície de meio sólido já solidificado e espalhar uniformemente; as colónias crescem somente na superfície.
    Agora vou descrever cada método passo a passo, explicando também como calcular a concentração final e quais cuidados/prós e contras.

Passo 3

Materiais típicos e condições (valores para memorizar e usar em prova):
  • Ágar nutritivo liquefeito mantido a cerca de 45^\circ\mathrm{C} (o suficiente para manter líquido, sem matar muitos microrganismos sensíveis).
  • Placas de Petri estéreis.
  • Pipetas estéreis (por exemplo, micropipeta para 1{,}0\,\mathrm{mL}).
  • Diluições seriadas preparadas previamente (tubos com solução salina estéril ou diluente).
    Cuidados de assepsia: trabalhar próximo a chama/ cabine de fluxo laminar, usar luvas, evitar contaminação cruzada.

Passo 4

  1. Escolher a diluição apropriada (aquela que provavelmente gerará entre 30 e 300 colónias por placa; esse intervalo é o ideal para contagem).
  2. Pipetar 1{,}0\,\mathrm{mL} (ou outro volume padronizado, frequentemente 1{,}0\,\mathrm{mL}) da diluição escolhida diretamente para o fundo de uma placa de Petri estéril. Declare na prova o volume usado.
  3. Preparar o ágar: aquecer até liquefazer, depois resfriar até aproximadamente 45^\circ\mathrm{C} para não matar microrganismos; mantenha o ágar nessa temperatura.
  4. Verter imediatamente 15 20\,\mathrm{mL} do ágar líquido na placa que já contém a alíquota.
  5. Fechar a placa e girar suavemente (ou rodopiar) para misturar o inoculo no ágar de modo uniforme; evitar formação de bolhas.
  6. Deixar solidificar (normalmente alguns minutos) com a tampa fechada.
  7. Incubar na temperatura e tempo apropriados para o organismo de interesse (por ex., 37^\circ\mathrm{C} por 24 48 horas, dependendo do microrganismo).
  8. Após incubação, contar colónias — lembrar que haverá colónias na superfície e colónias embutidas no interior do ágar (geralmente menores e mais difusas).

Passo 5

  • Vantagens: permite a platagem de volumes maiores (normalmente 1{,}0\,\mathrm{mL}), aumentando sensibilidade quando a amostra é muito diluída; permite o crescimento de microrganismos que toleram ou preferem ambientes menos aeróbicos (colónias embutidas).
  • Desvantagens: o calor do ágar pode prejudicar microrganismos termossensíveis; colónias embutidas são menores e mais difíceis de contar, o que pode reduzir exatidão; mais trabalho de preparação (manter ágar em temperatura adequada).
  • Observação prática para prova: se o enunciado mencionar organismos sensíveis ao calor, explique que o método de incorporação pode subestimar a contagem.

Passo 6

Materiais típicos e condições:
  • Placas de Petri com ágar já solidificado (seco, sem líquido na superfície).
  • Pipetas estéreis para volumes pequenos, tipicamente 0{,}1\,\mathrm{mL} (ou 0{,}05 0{,}2\,\mathrm{mL}). O valor mais comum em provas é 0{,}1\,\mathrm{mL}.
  • Espátula de vidro esterilizada (hockey stick), ou esferas de vidro estéreis (glass beads) ou spreader descartável.
  • Controle de assepsia idem ao método anterior.

Passo 7

  1. Escolher a diluição que deve resultar em uma contagem entre 30 e 300 colónias por placa.
  2. Pipetar uma alíquota conhecida da diluição, normalmente 0{,}1\,\mathrm{mL}, sobre a superfície do ágar previamente solidificado. (Se usar outra alíquota, indicar sempre esse volume ao calcular.)
  3. Imediatamente espalhar a alíquota por toda a superfície usando uma lamela esterilizada/espátula ou agitar a placa contendo esferas de vidro para dispersar a gota; a técnica deve cobrir uniformemente a área da placa.
  4. Deixar a placa em posição horizontal até que a solução seja absorvida pelo ágar (alguns minutos). Evitar levantar a tampa durante espalhamento.
  5. Incubar nas condições apropriadas (temperatura e tempo).
  6. Após incubação, contar as colónias, que estarão todas na superfície do ágar.

Passo 8

  • Vantagens: não há exposição ao calor (bom para organismos sensíveis); colónias crescem na superfície, geralmente maiores e mais fáceis de contar; técnica simples e rápida.
  • Desvantagens: normalmente só se pode colocar volumes pequenos ( 0{,}1\,\mathrm{mL}), logo se a amostra for muito diluída pode ser necessário menos diluição ou múltiplas placas; organismos microaerófilos/anaeróbicos podem não crescer bem apenas na superfície.
  • Observação prática: spread plate é muito usada para amostras que já não são extremamente diluídas e quando se quer contagem mais nítida das colónias.

Passo 9

É essencial saber calcular a concentração a partir da placa contada. A fórmula padrão é:
\text{CFU/mL}=\frac{N}{V\cdot D}
onde:
  • N é o número de colónias contadas na placa;
  • V é o volume efetivamente platado, em mililitros (por ex., V=0{,}1\,\mathrm{mL} ou V=1{,}0\,\mathrm{mL});
  • D é o fator de diluição (em fração, por exemplo \,10^{-4} para a diluição de 10^{-4}).
Exemplo prático passo a passo (boa para prova): se uma placa preparada por espalhamento recebeu 0{,}1\,\mathrm{mL} da diluição 10^{-4} e após incubação foram contadas 150 colónias, então:
\text{CFU/mL}=\frac{150}{0{,}1\cdot 10^{-4}}=\frac{150}{10^{-5}}=150\times 10^{5}=1{,}5\times 10^{7}\\ \text{CFU/mL}.
Explanação: dividir por V corrige pelo fato de ter sido platado menos que 1\,\mathrm{mL}; dividir por D corrige pela diluição feita antes da platagem.

Passo 10

  • Sempre platem réplicas (pelo menos duplicatas) em diluições consecutivas; na prática escolhe-se a placa cujo número de colónias caia no intervalo 30 300.
  • Anotar claramente: volume platado e diluição usada; isso é imprescindível para calcular CFU/mL.
  • Controles: placa com meio estéril sem amostra (controle negativo) para checar contaminação; se houver contaminação, os resultados são inválidos.
  • Em prova: se perguntarem “por que usar 0{,}1\,\mathrm{mL} no espalhamento?”, explique que é padrão porque espalhar mais pode formar poças e dificultar a absorção; se for incorporação, justificar uso de 1{,}0\,\mathrm{mL} por aumentar sensibilidade.
  • Erros comuns que caem em prova: esquecer de converter volume para mL na fórmula; usar o “recíproco da diluição” sem ajustar consistentemente. Lembre-se da fórmula como está no Passo 9 para evitar confusão.

Passo 11

  • Incorporação em placa: mistura inoculo com ágar líquido, solidifica, colónias na superfície e no interior; platagem de volumes maiores; cuidado com calor.
  • Espalhamento em placa: deposita alíquota sobre ágar sólido e espalha; colónias só na superfície; melhor para organismos sensíveis ao calor e para contagens nítidas.

Resposta

Incorporação em placa: mistura-se uma alíquota conhecida da diluição com ágar líquido resfriado ( \approx45^\circ\mathrm{C}), verte-se na placa, deixa-se solidificar e incuba-se; as colónias crescem na superfície e dentro do ágar, possibilitando platagem de volumes maiores (ex.: 1{,}0\,\mathrm{mL}), mas o calor pode afetar microrganismos sensíveis e colónias internas são mais difíceis de contar.
Espalhamento em placa: deposita-se uma pequena alíquota conhecida sobre ágar já solidificado (ex.: 0{,}1\,\mathrm{mL}) e espalha-se uniformemente com um spreader ou esferas de vidro; as colónias crescem somente na superfície, são fáceis de contar e não há exposição ao calor, mas permite platagem de volumes menores exigindo diluições ajustadas.

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