A cinética de uma enzima é medida em função da concentração do substrato, na presença e na ausência de inibidor (I) 2 mM .
[\mathrm{S}]
(\mu \mathbf{M})
Velocidade (\mu mol/minuto)
Sem inibidor
3 10,4 Com inibidor
5 14,5 4,1
10 22,5 6,4
30 33,8 11,3
90 40,5 22,6

Passo 1

O enunciado dá uma curva de velocidade enzimática medida em função da concentração de substrato [S] nas duas condições: sem inibidor e com inibidor (concentração do inibidor [I]=2\\ \mathrm{mM}). As informações relevantes (peguei os números na tabela do enunciado) são:
[S] (µM) e velocidades v (µmol/min) — os pares usados são:
\begin{array}{ccc} [S]\\ (\mu\mathrm{M}) & \text{Sem inibidor }v & \text{Com inibidor }v\\\\ 5 & 14,5 & 4,1\\\\ 10 & 22,5 & 6,4\\\\ 30 & 33,8 & 11,3\\\\ 90 & 40,5 & 22,6 \end{array}
Observação: na tabela enviada a linha de [S]=3\\ \mu\mathrm{M} ficou mal formatada (o valor para “com inibidor” não apareceu claramente). Por isso, optei por usar as quatro linhas completas (5, 10, 30, 90 µM) para estimar parâmetros — isso é suficiente e comum em provas quando uma linha está corrompida.
O que vou determinar:
  • identificar qualitativamente o tipo de inibição observado;
  • estimar V_{\max} e K_{m} na ausência e na presença do inibidor;
  • estimar constantes de afinidade do inibidor ( K_{is} e K_{ii}) assumindo o modelo de inibição mista (se for o caso).

Passo 2

Rápida revisão teórica (sem pular etapas):
  • A equação de Michaelis–Menten é
v=\frac{V_{\max}[S]}{K_{m}+[S]},
onde:
  • v é a velocidade inicial da reação (µmol/min),
  • V_{\max} é a velocidade máxima quando a enzima está saturada (µmol/min),
  • K_{m} é a constante de Michaelis (concentração de substrato em que v=V_{\max}/2; em µM),
  • [S] é a concentração de substrato (µM).
  • Para identificar tipo de inibição e estimar K_{m} e V_{\max} linearizamos a equação. Uma forma prática e menos sujeita a exagero de erros quando se faz no papel é a forma de Eadie–Hofstee:
v = -K_{m}\cdot\frac{v}{[S]} + V_{\max}.
Nessa forma fazemos um gráfico de v (eixo y) versus v/[S] (eixo x). A inclinação é -K_{m} e o intercepto em y é V_{\max}.
  • Sobre tipos de inibição (resumo prático para identificar):
    • Competitiva: V_{\max} inalterado, K_{m} aparente aumenta.
    • Não-competitiva pura: K_{m} inalterado, V_{\max} diminui.
    • Mista: tanto K_{m} quanto V_{\max} mudam.
    • Em um gráfico Eadie–Hofstee as retas dos dois estados (com/sem inibidor) se deslocam de forma característica; comparar V_{\max} e K_{m} estimados indica o tipo.

Passo 3

Escolha do método: uso a forma Eadie–Hofstee porque é fácil de aplicar manualmente com os poucos pontos tabelados (basta calcular v/[S] e fazer uma reta). Ela dá diretamente K_{m} (menos chance de dar excesso de peso aos pontos de baixa concentração, problema comum do Lineweaver–Burk).
Vou calcular v/[S] para cada ponto, montar dois conjuntos (sem e com inibidor), e obter uma estimativa da reta usando aproximação por dois pontos extremos — aqui vou também mostrar que usando pares distintos obtemos valores consistentes, para dar confiança no resultado.

Passo 4

Calcular v/[S] (peguei v e [S] da tabela):
Sem inibidor:
\begin{aligned} [S]=5\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=14,5\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{14,5}{5}=2,90\\\ [S]=10\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=22,5\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{22,5}{10}=2,25\\\ [S]=30\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=33,8\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{33,8}{30}\approx1,1267\\\ [S]=90\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=40,5\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{40,5}{90}=0,45 \end{aligned}
Com inibidor ( [I]=2\\ \mathrm{mM}=2000\\ \mu\mathrm{M}):
\begin{aligned} [S]=5\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=4,1\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{4,1}{5}=0,82\\\ [S]=10\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=6,4\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{6,4}{10}=0,64\\\ [S]=30\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=11,3\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{11,3}{30}\approx0,3767\\\ [S]=90\\ \mu\mathrm{M},&\\ v=22,6\\ \Rightarrow\\ \frac{v}{[S]}=\frac{22,6}{90}\approx0,2511 \end{aligned}

Passo 5

Estimativa de K_{m} e V_{\max} (sem inibidor) usando dois pares extremos na forma Eadie–Hofstee:
A reta é v = m\cdot x + b com x=v/[S], m=-K_{m}, b=V_{\max}.
Escolho os pontos extremos (x_1,y_1)=(2,90,\\\ 14,5) e (x_2,y_2)=(0,45,\\\ 40,5).
Calculo da inclinação:
m=\frac{y_2-y_1}{x_2-x_1}=\frac{40,5-14,5}{0,45-2,90}=\frac{26}{-2,45}\approx-10,612.
Logo
K_{m}\approx -m \approx 10,612\\ \mu\mathrm{M}.
Intercepto:
V_{\max}=b=y_1 - m x_1 = 14,5 - (-10,612)\cdot 2,90 \approx 14,5 +30,7848 \approx 45,2848\\ \mu\mathrm{mol/min}.
Para verificar estabilidade, usei também os pontos médios (2,25,22,5) e (1,1267,33,8):
m'=\frac{33,8-22,5}{1,1267-2,25}=\frac{11,3}{-1,1233}\approx-10,06,
o que dá K_{m}\approx10,06\\ \mu\mathrm{M} e V_{\max}\approx45,14\\ \mu\mathrm{mol/min}. Os dois conjuntos dão valores muito próximos; portanto tomo como estimativa média e arredondada:
K_{m}\approx10,2\\ \mu\mathrm{M},\qquad V_{\max}\approx45,2\\ \mu\mathrm{mol/min}.

Passo 6

Estimativa de K_{m} e V_{\max} (com inibidor) pelo mesmo procedimento.
Pontos extremos (x_1,y_1)=(0,82,\\\ 4,1) e (x_2,y_2)=(0,2511,\\\ 22,6).
Inclinação:
m=\frac{22,6-4,1}{0,2511-0,82}=\frac{18,5}{-0,5689}\approx-32,52.
Logo
K_{m}^{\text{(apparent)}}\approx -m \approx 32,52\\ \mu\mathrm{M}.
Intercepto:
V_{\max}^{\text{(apparent)}}=4,1 - (-32,52)\cdot 0,82 \approx 4,1 +26,6664 \approx 30,7664\\ \mu\mathrm{mol/min}.
Arredondando:
K_{m}^{\text{(app)}}\approx32,5\\ \mu\mathrm{M},\qquad V_{\max}^{\text{(app)}}\approx30,8\\ \mu\mathrm{mol/min}.

Passo 7

Interpretar os resultados (tipo de inibição):
  • Sem inibidor: \displaystyle K_{m}\approx10,2\\ \mu\mathrm{M},\\ V_{\max}\approx45,2\\ \mu\mathrm{mol/min}.
  • Com inibidor: \displaystyle K_{m}^{\text{(app)}}\approx32,5\\ \mu\mathrm{M},\\ V_{\max}^{\text{(app)}}\approx30,8\\ \mu\mathrm{mol/min}.
Observação: na presença do inibidor ambos K_{m} e V_{\max} mudam ( K_{m} aumenta e V_{\max} diminui). Isso é característica de uma inibição mista (nem puramente competitiva nem puramente não-competitiva). Logo classificamos como: inibição mista (tendendo a competitiva, já que o aumento de K_{m} é relativamente grande em comparação à redução de V_{\max}).

Passo 8

Estimativa das constantes de afinidade do inibidor ( K_{is} e K_{ii}) no modelo de inibição mista:
No modelo genérico de inibição mista temos fatores:
\alpha = \frac{K_{m}^{\text{(app)}}}{K_{m}},\qquad \alpha' = \frac{V_{\max}}{V_{\max}^{\text{(app)}}}.
E relacionam-se com as constantes pela:
\alpha = 1+\frac{[I]}{K_{is}},\qquad \alpha' = 1+\frac{[I]}{K_{ii}},
onde [I]=2\\ \mathrm{mM}=2000\\ \mu\mathrm{M}.
Calcule \alpha e \alpha':
\alpha=\frac{32,5}{10,2}\approx3,186,\qquad \alpha'=\frac{45,2}{30,8}\approx1,4675.
Logo
K_{is}=\frac{[I]}{\alpha-1}=\frac{2000}{3,186-1}=\frac{2000}{2,186}\approx915,1\\ \mu\mathrm{M}\approx0,915\\ \mathrm{mM},
K_{ii}=\frac{[I]}{\alpha'-1}=\frac{2000}{1,4675-1}=\frac{2000}{0,4675}\approx4278\\ \mu\mathrm{M}\approx4,28\\ \mathrm{mM}.
Interpretação: o inibidor liga-se tanto à enzima livre (constante K_{is}) quanto ao complexo enzima–substrato (constante K_{ii}), com afinidade maior para a enzima livre ( K_{is} menor), reforçando que é inibição mista com tendência competitiva.

Passo 9

Resumo prático para a prova (como aplicar essa técnica rápido no exame):
  • Calcule v/[S] para cada ponto.
  • Faça uma reta Eadie–Hofstee aproximada unindo pontos extremos — a inclinação negativa é -K_{m} e o intercepto é V_{\max}.
  • Compare K_{m} e V_{\max} entre condições: só K_{m} muda → competitiva; só V_{\max} muda → não-competitiva; ambos mudam → mista.
  • Se pedirem K_i, use as relações \alpha=K_{m}^{\text{(app)}}/K_{m}=1+[I]/K_{is} e \alpha'=V_{\max}/V_{\max}^{\text{(app)}}=1+[I]/K_{ii}.
Você está indo bem — mesmo com a tabela um pouco bagunçada conseguimos extrair os parâmetros principais. Vai dar para usar esse procedimento na prova sem calculadora, fazendo as divisões e multiplicações com cuidado.

Resposta

Inibição mista (ambos K_{m} e V_{\max} mudam).
Sem inibidor: K_{m}\approx10,2\\ \mu\mathrm{M}; V_{\max}\approx45,2\\ \mu\mathrm{mol/min}.
Com inibidor ( [I]=2\\ \mathrm{mM}): K_{m}^{\text{(app)}}\approx32,5\\ \mu\mathrm{M}; V_{\max}^{\text{(app)}}\approx30,8\\ \mu\mathrm{mol/min}.
Constantes do inibidor (modelo misto): K_{is}\approx0,915\\ \mathrm{mM} e K_{ii}\approx4,28\\ \mathrm{mM}.

Exercícios relacionados