A cinética de uma enzima é medida em função da concentração do substrato, na presença e na ausência de inibidor (I) 2 mM .
Velocidade
mol/minuto)
Sem inibidor
3
10,4
Com inibidor
5
14,5
4,1
10
22,5
6,4
30
33,8
11,3
90
40,5
22,6
|
|
|||||
| 3 | 10,4 | Com inibidor | ||||
| 5 | 14,5 | 4,1 | ||||
| 10 | 22,5 | 6,4 | ||||
| 30 | 33,8 | 11,3 | ||||
| 90 | 40,5 | 22,6 | ||||
Passo 1
O enunciado dá uma curva de velocidade enzimática medida em função da concentração de substrato
nas duas condições: sem inibidor e com inibidor (concentração do inibidor
). As informações relevantes (peguei os números na tabela do enunciado) são:
Observação: na tabela enviada a linha de
ficou mal formatada (o valor para “com inibidor” não apareceu claramente). Por isso, optei por usar as quatro linhas completas (5, 10, 30, 90 µM) para estimar parâmetros — isso é suficiente e comum em provas quando uma linha está corrompida.
O que vou determinar:
- identificar qualitativamente o tipo de inibição observado;
- estimar
e na ausência e na presença do inibidor; - estimar constantes de afinidade do inibidor (
e ) assumindo o modelo de inibição mista (se for o caso).
Passo 2
Rápida revisão teórica (sem pular etapas):
- A equação de Michaelis–Menten é
onde:
-
é a velocidade inicial da reação (µmol/min), -
é a velocidade máxima quando a enzima está saturada (µmol/min), -
é a constante de Michaelis (concentração de substrato em que ; em µM), -
é a concentração de substrato (µM). -
Para identificar tipo de inibição e estimar
e linearizamos a equação. Uma forma prática e menos sujeita a exagero de erros quando se faz no papel é a forma de Eadie–Hofstee:
Nessa forma fazemos um gráfico de
(eixo
) versus
(eixo
). A inclinação é
e o intercepto em
é
.
- Sobre tipos de inibição (resumo prático para identificar):
- Competitiva:
inalterado, aparente aumenta. - Não-competitiva pura:
inalterado, diminui. - Mista: tanto
quanto mudam. - Em um gráfico Eadie–Hofstee as retas dos dois estados (com/sem inibidor) se deslocam de forma característica; comparar
e estimados indica o tipo.
- Competitiva:
Passo 3
Escolha do método: uso a forma Eadie–Hofstee porque é fácil de aplicar manualmente com os poucos pontos tabelados (basta calcular
e fazer uma reta). Ela dá diretamente
(menos chance de dar excesso de peso aos pontos de baixa concentração, problema comum do Lineweaver–Burk).
Vou calcular
para cada ponto, montar dois conjuntos (sem e com inibidor), e obter uma estimativa da reta usando aproximação por dois pontos extremos — aqui vou também mostrar que usando pares distintos obtemos valores consistentes, para dar confiança no resultado.
Passo 4
Calcular
(peguei
e
da tabela):
Sem inibidor:
Com inibidor (
):
Passo 5
Estimativa de
e
(sem inibidor) usando dois pares extremos na forma Eadie–Hofstee:
A reta é
com
,
,
.
Escolho os pontos extremos
e
.
Calculo da inclinação:
Logo
Intercepto:
Para verificar estabilidade, usei também os pontos médios
e
:
o que dá
e
. Os dois conjuntos dão valores muito próximos; portanto tomo como estimativa média e arredondada:
Passo 6
Estimativa de
e
(com inibidor) pelo mesmo procedimento.
Pontos extremos
e
.
Inclinação:
Logo
Intercepto:
Arredondando:
Passo 7
Interpretar os resultados (tipo de inibição):
- Sem inibidor:
- Com inibidor:
Observação: na presença do inibidor ambos
e
mudam (
aumenta e
diminui). Isso é característica de uma inibição mista (nem puramente competitiva nem puramente não-competitiva). Logo classificamos como: inibição mista (tendendo a competitiva, já que o aumento de
é relativamente grande em comparação à redução de
).
Passo 8
Estimativa das constantes de afinidade do inibidor (
e
) no modelo de inibição mista:
No modelo genérico de inibição mista temos fatores:
E relacionam-se com as constantes pela:
onde
.
Calcule
e
:
Logo
Interpretação: o inibidor liga-se tanto à enzima livre (constante
) quanto ao complexo enzima–substrato (constante
), com afinidade maior para a enzima livre (
menor), reforçando que é inibição mista com tendência competitiva.
Passo 9
Resumo prático para a prova (como aplicar essa técnica rápido no exame):
- Calcule
para cada ponto. - Faça uma reta Eadie–Hofstee aproximada unindo pontos extremos — a inclinação negativa é
e o intercepto é . - Compare
e entre condições: só muda → competitiva; só muda → não-competitiva; ambos mudam → mista. - Se pedirem
, use as relações e .
Você está indo bem — mesmo com a tabela um pouco bagunçada conseguimos extrair os parâmetros principais. Vai dar para usar esse procedimento na prova sem calculadora, fazendo as divisões e multiplicações com cuidado.
Resposta
Inibição mista (ambos
e
mudam).
Sem inibidor:
;
.
Com inibidor (
):
;
.
Constantes do inibidor (modelo misto):
e
.