Como a eficiência de uma separacao por HPLC pode ser quantificada?
Passo 1
O enunciado pergunta “Como a eficiência de uma separação por HPLC pode ser quantificada?”
Conteúdo: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e teoria de pratos teóricos.
O que vamos precisar:
• Conceito de pratos teóricos (theoretical plates)
• Fórmulas para número de pratos (N) e altura equivalente a um prato (H, também chamada de HETP)
• Fórmula de resolução (Rs), se quisermos comparar dois picos
Conteúdo: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e teoria de pratos teóricos.
O que vamos precisar:
• Conceito de pratos teóricos (theoretical plates)
• Fórmulas para número de pratos (N) e altura equivalente a um prato (H, também chamada de HETP)
• Fórmula de resolução (Rs), se quisermos comparar dois picos
Passo 2
Primeiro, vamos entender o que é “prato teórico”.
Imagina que a coluna HPLC fosse dividida em várias etapas onde a soluta entra em equilíbrio instantâneo entre fase móvel e estacionária. Cada etapa dessas é um “prato teórico”. Quanto mais pratos, mais fina é a separação e mais estreitos são os picos no cromatograma.
Imagina que a coluna HPLC fosse dividida em várias etapas onde a soluta entra em equilíbrio instantâneo entre fase móvel e estacionária. Cada etapa dessas é um “prato teórico”. Quanto mais pratos, mais fina é a separação e mais estreitos são os picos no cromatograma.
Passo 3
O número de pratos teóricos (N) pode ser calculado pela largura do pico no cromatograma. As fórmulas mais comuns são:
- Usando a largura no base do pico (W):
onde
• = tempo de retenção do pico (tempo até o topo do pico)
• = largura do pico na linha de base
•
•
- Usando a largura a meia altura do pico (
):
Depois de achar
, calculamos a altura equivalente a um prato (HETP), que indica “o tamanho médio” de cada prato:
onde
é o comprimento da coluna (em cm). Quanto menor
, mais eficiente a coluna.
Passo 4
Além de
e
, outra forma de quantificar a eficiência comparando dois picos é a resolução
. Ela mostra o quão bem separados estão os picos de dois analitos:
onde
• e
são os tempos de retenção dos picos 1 e 2, respectivamente
• e
são as larguras na base desses picos
•
•
Valores típicos:
• de milhares a dezenas de milhares de pratos
• de micrômetros a dezenas de mícrons
• indica boa separação (picos baseline-separated)
•
•
•
Resposta
A eficiência de uma separação HPLC é quantificada principalmente por:
• Número de pratos teóricos:
• Número de pratos teóricos:
• Altura equivalente a um prato (HETP):
• E, para comparar dois picos, resolução: