Imagine que um aluno precisa desenhar primers para realizar uma
, cujo alvo de amplificação é a sequencia destacada abaixo. Sabendo que a forma mais simples de determinar os valores de Tm de ambos os primers é pela equação
. Apresente dois possiveis primers para a amplificação da sequência, além dos seus valores de Tm.
5' - CGCGCATGCGTA/TTTTTTTTTTTTTAAATGTACT...GATCGTACGTAGCTAGTAGCTGATC/GTAGCTAGCGCC -3'
- GCGCGTACGCAT | AAAAAAAAAAAAATTTACATGA…CTAGCATGCATCGATCATCGACTAG|CATCGATCGGCG -
sequência alvo da amplificação
sequência alvo da amplificação
Passo 1
O enunciado pede que a gente projete dois primers (forward e reverse) para amplificar a região delimitada por “/ … /” na sequência:
5′-CGCGCATGCGTA/TTTTTTTTTTTTTAAATGTACT…GATCGTACGTAGCTAGTAGCTGATC/GTAGCTAGCGCC-3′
O conteúdo é projeto de primers em PCR, usando a fórmula de Tm aproximada
5′-CGCGCATGCGTA/TTTTTTTTTTTTTAAATGTACT…GATCGTACGTAGCTAGTAGCTGATC/GTAGCTAGCGCC-3′
O conteúdo é projeto de primers em PCR, usando a fórmula de Tm aproximada
Precisamos escolher ~18–22 nt com boa composição, calcular quantos
,
,
e
têm e aplicar a fórmula.
Passo 2
Escolhemos o primer forward logo à esquerda do alvo, na faixa 5′…/ do sentido direto. Uma opção de 19 nt é
5′-CGCGCATGCGTATTTTTTT-3′.
Agora contamos as bases: .
Aplicando
5′-CGCGCATGCGTATTTTTTT-3′.
Agora contamos as bases:
Aplicando
Passo 3
Para o primer reverse escolhemos 20 nt logo à direita do alvo, mas no filamento complementar. Tomamos a sequência direta
5′-GATCGTACGTAGCTAGTAGC-3′
e geramos seu reverso-complementar, que será nosso primer (5′ ′):
5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′.
Contagem: .
Logo
5′-GATCGTACGTAGCTAGTAGC-3′
e geramos seu reverso-complementar, que será nosso primer (5′
5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′.
Contagem:
Logo
Passo 4
Ambos os primers têm comprimentos entre 18 e 22 nt, Tm próximos (54 vs.
C) e conteúdo GC razoável, adequados para PCR padrão.
Resposta
Forward: 5′-CGCGCATGCGTATTTTTTT-3′,
Reverse: 5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′,
Reverse: 5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′,