Imagine que um aluno precisa desenhar primers para realizar uma P C R, cujo alvo de amplificação é a sequencia destacada abaixo. Sabendo que a forma mais simples de determinar os valores de Tm de ambos os primers é pela equação \mathrm{Tm} \approx 2^{\circ} \mathrm{C} \times(A+T)+4^{\circ} \mathrm{C} \times(G+C). Apresente dois possiveis primers para a amplificação da sequência, além dos seus valores de Tm.

5' - CGCGCATGCGTA/TTTTTTTTTTTTTAAATGTACT...GATCGTACGTAGCTAGTAGCTGATC/GTAGCTAGCGCC -3'

3^{\prime} - GCGCGTACGCAT | AAAAAAAAAAAAATTTACATGA…CTAGCATGCATCGATCATCGACTAG|CATCGATCGGCG - 5^{\prime}
sequência alvo da amplificação

Passo 1

O enunciado pede que a gente projete dois primers (forward e reverse) para amplificar a região delimitada por “/ … /” na sequência:
5′-CGCGCATGCGTA/TTTTTTTTTTTTTAAATGTACT…GATCGTACGTAGCTAGTAGCTGATC/GTAGCTAGCGCC-3′
O conteúdo é projeto de primers em PCR, usando a fórmula de Tm aproximada
\mathrm{Tm}\approx 2^\circ\mathrm{C}\times(A+T)\;+\;4^\circ\mathrm{C}\times(G+C).
Precisamos escolher ~18–22 nt com boa composição, calcular quantos A, T, G e C têm e aplicar a fórmula.

Passo 2

Escolhemos o primer forward logo à esquerda do alvo, na faixa 5′…/ do sentido direto. Uma opção de 19 nt é
5′-CGCGCATGCGTATTTTTTT-3′.
Agora contamos as bases: \;A+T=11,\;G+C=8.
Aplicando
\mathrm{Tm}=2\times 11 + 4\times 8 = 22 +32 =54\,^\circ\mathrm{C}.

Passo 3

Para o primer reverse escolhemos 20 nt logo à direita do alvo, mas no filamento complementar. Tomamos a sequência direta
5′-GATCGTACGTAGCTAGTAGC-3′
e geramos seu reverso-complementar, que será nosso primer (5′ \to 3′):
5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′.
Contagem: \;A+T=12,\;G+C=8.
Logo
\mathrm{Tm}=2\times 12 + 4\times 8 = 24 +32 =56\,^\circ\mathrm{C}.

Passo 4

Ambos os primers têm comprimentos entre 18 e 22 nt, Tm próximos (54 vs. 56\circC) e conteúdo GC razoável, adequados para PCR padrão.

Resposta

Forward: 5′-CGCGCATGCGTATTTTTTT-3′, \mathrm{Tm}\approx54\,^\circ\mathrm{C}.
Reverse: 5′-GCTACTAGCTACGTACGATC-3′, \mathrm{Tm}\approx56\,^\circ\mathrm{C}.

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