A penicilina é hidrolisada e assim tornada inativa pela penicilinase (também conhecida como
lactamase), uma enzima presente em algumas bactérias resistentes a antibióticos. A massa desta enzima no Staphylococcus aureus é de
. A quantidade de penicilina hidrolisada em 1 minuto, em 10 ml de uma solução contendo
de penicilinase purificada, foi medida em função da concentração de penicilina. Suponha que a concentração de penicilina não varie apreciavelmente durante o ensaio.
[Penicilina]
Quantidade hidrolisada
nanomoles
1
0,11
3
0,25
5
0,34
10
0,45
30
0,58
50
0,61
|
|
||||
| 1 | 0,11 | ||||
| 3 | 0,25 | ||||
| 5 | 0,34 | ||||
| 10 | 0,45 | ||||
| 30 | 0,58 | ||||
| 50 | 0,61 |
Passo 1
O enunciado dá os seguintes dados importantes:
- Massa molecular (massa molar) da penicilinase:
(ou seja ). - Foi usada uma quantidade de penicilinase igual a
dissolvida em . - Mediu‑se a quantidade de penicilina hidrolisada em 1 minuto (ou seja, é uma velocidade inicial
em unidade de quantidade por tempo) para várias concentrações iniciais de penicilina. A tabela fornecida (já copiada do enunciado) é:
O enunciado também pede (implícito para esse tipo de problema): determinar os parâmetros cinéticos da enzima no modelo de Michaelis–Menten — isto é, obter
e
— e calcular o número de turnovers (turnover number)
da enzima dada a quantidade usada. Suponha que a concentração de substrato não varia apreciavelmente durante o ensaio (condição de velocidade inicial).
Passo 2
Breve aula prática sobre o que vamos usar (Michaelis–Menten), sem jargões desnecessários:
- A equação de Michaelis–Menten descreve a dependência da velocidade inicial
com a concentração de substrato :
onde:
-
é a velocidade inicial (unidade: concentração por tempo, por ex. ); -
é a velocidade máxima quando a enzima está saturada de substrato (mesma unidade que ); -
é a constante de Michaelis (unidade de concentração, ex. ); representa a concentração de substrato na qual . -
Para obter
e a partir de dados experimentais frequentemente usamos a forma linearizada Lineweaver–Burk:
Nessa forma,
versus
é uma reta com coeficiente angular
e intercepto em
igual a
. É uma ferramenta prática para extrair
e
de forma direta.
- O número de turnovers
(também chamado constante catalítica) é:
onde
é a concentração molar total de enzima presente na reação. A unidade usual de
é
(ou
) dependendo das unidades de
.
Passo 3
Converter os dados experimentais de “nanomoles hidrolisados em 1 min em 10 mL” para velocidade em concentração por tempo (vou usar
, que é prático aqui).
- Uma razão rápida:
. Em , isso corresponde a uma concentração:
Portanto, para converter “nanomoles em 10 mL” para
basta multiplicar por
.
Aplicando isso aos valores da tabela obtemos as velocidades iniciais
(em
), porque as quantidades foram medidas em 1 minuto:
(Resumo:
varia de
a
. Observação leve: os valores parecem saturar perto de
, então
será algo nessa vizinhança.)
Passo 4
Preparar os dados para a linearização Lineweaver–Burk. Para cada par
calculamos
(em
) e
(em
):
Vou mostrar os cálculos principais (apenas os valores resultantes, já que a multiplicação e divisão são diretas):
(esses são os recíprocos dos valores do passo anterior; por exemplo, para
temos
.)]
Passo 5
Extrair
e
pela forma linearizada. Para ser prático e didático, vou usar a aproximação de ajustar uma reta usando dois pontos bem separados da reta
vs
(isso dá uma boa estimativa simples; método mais sofisticado seria regressão linear de todos os pontos, mas essa aproximação já é pedagógica e suficiente em prova).
Escolho os pontos extremos para maior precisão:
e
.
A inclinação e o intercepto
da reta
são:
A inclinação
Na forma Lineweaver–Burk,
e
Calculando:
Comentário intuitivo de verificação: em
(próximo de
) a velocidade experimental é
, que é aproximadamente metade de
, o que confirma que nosso
faz sentido.
Passo 6
Calcular a concentração molar de enzima
a partir da massa usada.
- Massa de enzima usada:
. - Massa molar:
.
Moles de enzima:
Volume da solução:
. Portanto a concentração molar:
Para trabalhar com as mesmas unidades de
em
é útil expressar
em
:
(Resumo numérico:
.)
Passo 7
Calcular
:
Usando
e
(em unidades compatíveis de
):
Converter para segundos
(dividindo por
):
Interpretação rápida: cada molécula de enzima hidrolisa, em média, cerca de
moléculas de penicilina por segundo nas condições de saturação — um valor razoável para uma enzima eficiente.
Passo 8
Pequeno check numérico (opcional mas didático): usando os parâmetros estimados, a velocidade na concentração
seria prevista por Michaelis–Menten como
que está bem próximo do valor experimental
. Isso dá confiança nas estimativas obtidas.