A penicilina é hidrolisada e assim tornada inativa pela penicilinase (também conhecida como \beta lactamase), uma enzima presente em algumas bactérias resistentes a antibióticos. A massa desta enzima no Staphylococcus aureus é de 29,6 \mathrm{kDa}. A quantidade de penicilina hidrolisada em 1 minuto, em 10 ml de uma solução contendo 10^{-9} \mathrm{~g} de penicilinase purificada, foi medida em função da concentração de penicilina. Suponha que a concentração de penicilina não varie apreciavelmente durante o ensaio.
[Penicilina]
(\boldsymbol{\mu} \mathbf{M})
Quantidade hidrolisada
( nanomoles )
1 0,11
3 0,25
5 0,34
10 0,45
30 0,58
50 0,61

Passo 1

O enunciado dá os seguintes dados importantes:
  • Massa molecular (massa molar) da penicilinase: \;29{,}6\\ \mathrm{kDa} (ou seja \;29{,}600\\ \mathrm{g\cdot mol^{-1}}).
  • Foi usada uma quantidade de penicilinase igual a \;10^{-9}\\ \mathrm{g} dissolvida em \;10\\ \mathrm{mL}.
  • Mediu‑se a quantidade de penicilina hidrolisada em 1 minuto (ou seja, é uma velocidade inicial v em unidade de quantidade por tempo) para várias concentrações iniciais de penicilina. A tabela fornecida (já copiada do enunciado) é:
\begin{array}{cc} \text{[Penicilina] }(\mu\mathrm{M}) & \text{Quantidade hidrolisada (nanomoles em 1 min em 10 mL)}\\\\ 1 & 0{,}11\\\\ 3 & 0{,}25\\\\ 5 & 0{,}34\\\\ 10 & 0{,}45\\\\ 30 & 0{,}58\\\\ 50 & 0{,}61 \end{array}
O enunciado também pede (implícito para esse tipo de problema): determinar os parâmetros cinéticos da enzima no modelo de Michaelis–Menten — isto é, obter V_{\max} e K_m — e calcular o número de turnovers (turnover number) k_{\mathrm{cat}} da enzima dada a quantidade usada. Suponha que a concentração de substrato não varia apreciavelmente durante o ensaio (condição de velocidade inicial).

Passo 2

Breve aula prática sobre o que vamos usar (Michaelis–Menten), sem jargões desnecessários:
  • A equação de Michaelis–Menten descreve a dependência da velocidade inicial v com a concentração de substrato [S]:
v=\frac{V_{\max}[S]}{K_m+[S]}
onde:
  • v é a velocidade inicial (unidade: concentração por tempo, por ex. \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1});
  • V_{\max} é a velocidade máxima quando a enzima está saturada de substrato (mesma unidade que v);
  • K_m é a constante de Michaelis (unidade de concentração, ex. \mu\mathrm{M}); representa a concentração de substrato na qual v=V_{\max}/2.
  • Para obter V_{\max} e K_m a partir de dados experimentais frequentemente usamos a forma linearizada Lineweaver–Burk:
\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{\max}}
Nessa forma, \displaystyle\frac{1}{v} versus \displaystyle\frac{1}{[S]} é uma reta com coeficiente angular \displaystyle\frac{K_m}{V_{\max}} e intercepto em y igual a \displaystyle\frac{1}{V_{\max}}. É uma ferramenta prática para extrair V_{\max} e K_m de forma direta.
  • O número de turnovers k_{\mathrm{cat}} (também chamado constante catalítica) é:
k_{\mathrm{cat}}=\frac{V_{\max}}{[E]_{\text{total}}}
onde [E]_{\text{total}} é a concentração molar total de enzima presente na reação. A unidade usual de k_{\mathrm{cat}} é \mathrm{s^{-1}} (ou \mathrm{min^{-1}}) dependendo das unidades de V_{\max}.

Passo 3

Converter os dados experimentais de “nanomoles hidrolisados em 1 min em 10 mL” para velocidade em concentração por tempo (vou usar \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}, que é prático aqui).
  • Uma razão rápida: 1\\ \text{nanomol} = 1\times 10^{-9}\\ \mathrm{mol}. Em 10\\ \mathrm{mL}=0{,}01\\ \mathrm{L}, isso corresponde a uma concentração:
\frac{1\times 10^{-9}\\ \mathrm{mol}}{0{,}01\\ \mathrm{L}}=1\times 10^{-7}\\ \mathrm{mol\cdot L^{-1}}=0{,}1\\ \mu\mathrm{M}.
Portanto, para converter “nanomoles em 10 mL” para \mu\mathrm{M} basta multiplicar por 0{,}1.
Aplicando isso aos valores da tabela obtemos as velocidades iniciais v (em \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}), porque as quantidades foram medidas em 1 minuto:
\begin{array}{cc} \text{[Penicilina] }(\mu\mathrm{M}) & v\\ (\mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1})\\\\ 1 & 0{,}11\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}011\\\\ 3 & 0{,}25\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}025\\\\ 5 & 0{,}34\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}034\\\\ 10 & 0{,}45\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}045\\\\ 30 & 0{,}58\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}058\\\\ 50 & 0{,}61\\ \text{nm}\times 0{,}1 = 0{,}061 \end{array}
(Resumo: v varia de \;0{,}011 a \;0{,}061\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}. Observação leve: os valores parecem saturar perto de \sim0{,}06\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}, então V_{\max} será algo nessa vizinhança.)

Passo 4

Preparar os dados para a linearização Lineweaver–Burk. Para cada par ([S],v) calculamos \displaystyle\frac{1}{[S]} (em \mu\mathrm{M}^{-1}) e \displaystyle\frac{1}{v} (em \mathrm{min}\cdot\mu\mathrm{M}^{-1}):
Vou mostrar os cálculos principais (apenas os valores resultantes, já que a multiplicação e divisão são diretas):
\begin{array}{ccc} [S]\\ (\mu\mathrm{M}) & \dfrac{1}{[S]}\\ (\mu\mathrm{M}^{-1}) & \dfrac{1}{v}\\ (\mathrm{min}\cdot\mu\mathrm{M}^{-1})\\[6pt] 1 & 1{,}000000 & 90{,}9091\\\\ 3 & 0{,}333333 & 40{,}0000\\\\ 5 & 0{,}200000 & 29{,}4118\\\\ 10 & 0{,}100000 & 22{,}2222\\\\ 30 & 0{,}033333 & 17{,}2414\\\\ 50 & 0{,}020000 & 16{,}3934 \end{array}
(esses são os recíprocos dos valores do passo anterior; por exemplo, para [S]=1\\ \mu\mathrm{M} temos 1/v=1/0{,}011\approx 90{,}9091.)]

Passo 5

Extrair V_{\max} e K_m pela forma linearizada. Para ser prático e didático, vou usar a aproximação de ajustar uma reta usando dois pontos bem separados da reta 1/v vs 1/[S] (isso dá uma boa estimativa simples; método mais sofisticado seria regressão linear de todos os pontos, mas essa aproximação já é pedagógica e suficiente em prova).
Escolho os pontos extremos para maior precisão: ([S]=1,\;1/v=90{,}9091) e ([S]=50,\;1/v=16{,}3934).
A inclinação m e o intercepto b da reta \displaystyle\frac{1}{v}=m\cdot\frac{1}{[S]}+b são:
m=\frac{y_2-y_1}{x_2-x_1} =\frac{16{,}3934-90{,}9091}{0{,}02-1} \approx 76{,}05
b=y_2-mx_2 =16{,}3934-76{,}05\times 0{,}02 \approx 14{,}872
Na forma Lineweaver–Burk,
b=\frac{1}{V_{\max}}\quad\Rightarrow\quad V_{\max}=\frac{1}{b}
e
m=\frac{K_m}{V_{\max}}\quad\Rightarrow\quad K_m=m\cdot V_{\max}.
Calculando:
V_{\max}=\frac{1}{14{,}872}\approx 0{,}0672\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1},
K_m=76{,}05\times 0{,}0672\approx 5{,}11\\ \mu\mathrm{M}.
Comentário intuitivo de verificação: em [S]=5\\ \mu\mathrm{M} (próximo de K_m) a velocidade experimental é 0{,}034\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}, que é aproximadamente metade de V_{\max}\approx0{,}067, o que confirma que nosso K_m\approx5\\ \mu\mathrm{M} faz sentido.

Passo 6

Calcular a concentração molar de enzima [E]_{\text{total}} a partir da massa usada.
  • Massa de enzima usada: \;10^{-9}\\ \mathrm{g}.
  • Massa molar: \;29{,}600\\ \mathrm{g\cdot mol^{-1}}.
Moles de enzima:
n_E=\frac{10^{-9}\\ \mathrm{g}}{29{,}600\\ \mathrm{g\cdot mol^{-1}}} \approx 3{,}3784\times 10^{-14}\\ \mathrm{mol}.
Volume da solução: 10\\ \mathrm{mL}=0{,}01\\ \mathrm{L}. Portanto a concentração molar:
[E]_{\text{total}}=\frac{n_E}{0{,}01\\ \mathrm{L}} =3{,}3784\times 10^{-12}\\ \mathrm{M}.
Para trabalhar com as mesmas unidades de V_{\max} em \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1} é útil expressar [E] em \mu\mathrm{M}:
3{,}3784\times 10^{-12}\\ \mathrm{M}=3{,}3784\times 10^{-6}\\ \mu\mathrm{M}.
(Resumo numérico: [E]_{\text{total}}\approx 3{,}378\times 10^{-12}\\ \mathrm{M}.)

Passo 7

Calcular k_{\mathrm{cat}}:
Usando V_{\max}=0{,}0672\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1} e [E]_{\text{total}}=3{,}3784\times 10^{-6}\\ \mu\mathrm{M} (em unidades compatíveis de \mu\mathrm{M}):
k_{\mathrm{cat}}=\frac{V_{\max}}{[E]_{\text{total}}} =\frac{0{,}0672\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}}{3{,}3784\times 10^{-6}\\ \mu\mathrm{M}} \approx 1{,}99\times 10^{4}\\ \mathrm{min}^{-1}.
Converter para segundos ^{-1} (dividindo por 60):
k_{\mathrm{cat}}\approx \frac{1{,}99\times 10^{4}}{60}\\ \mathrm{s^{-1}} \approx 3{,}32\times 10^{2}\\ \mathrm{s^{-1}}.
Interpretação rápida: cada molécula de enzima hidrolisa, em média, cerca de 3,3\times 10^{2} moléculas de penicilina por segundo nas condições de saturação — um valor razoável para uma enzima eficiente.

Passo 8

Pequeno check numérico (opcional mas didático): usando os parâmetros estimados, a velocidade na concentração [S]=5\\ \mu\mathrm{M} seria prevista por Michaelis–Menten como
v=\frac{V_{\max}[S]}{K_m+[S]} =\frac{0{,}0672\times 5}{5{,}11+5}\approx\frac{0{,}336}{10{,}11}\approx 0{,}0332\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1},
que está bem próximo do valor experimental 0{,}034\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}. Isso dá confiança nas estimativas obtidas.

Resposta

V_{\max}\approx 0{,}0672\\ \mu\mathrm{M}\cdot\mathrm{min}^{-1}\n
K_m\approx 5{,}11\\ \mu\mathrm{M}\n
k_{\mathrm{cat}}\approx 1{,}99\times 10^{4}\\ \mathrm{min^{-1}}\;(\approx 3{,}32\times 10^{2}\\ \mathrm{s^{-1}})

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