Como se pode determinar a temperatura de fusão de um DNA duplex? Entre dois DNAs, qual o que tem maior temperatura de fusão: aquele com maior ou com menor percentagem de pares de bases G/C? Explique.
Passo 1
O enunciado pede para determinar a temperatura de fusão ™ de um DNA duplex e comparar dois duplexes com percentagens diferentes de pares G/C. Para isso precisamos usar o conceito de hipercromicidade do DNA (aumento de absorbância em 260 nm quando as fitas se separam) e entender como a composição de bases afeta a estabilidade térmica.
Passo 2
Para medir experimentalmente a Tm faz-se o seguinte: prepara-se uma solução do duplex e monitora-se a absorbância a
nm enquanto a temperatura varia lentamente. Inicialmente, o DNA está emparelhado (baixa absorbância); conforme a temperatura sobe, as fitas se separam e a absorbância aumenta (efeito hipercromático). A curva absorbância versus temperatura tem forma sigmoidal, e define-se
como a temperatura em que
das fitas estão despareadas (ponto médio da transição).
Do ponto de vista termodinâmico, a Tm satisfaz
Do ponto de vista termodinâmico, a Tm satisfaz
onde
e
são entalpia e entropia de hibridização,
é a constante dos gases e
a concentração efetiva de DNA. Bases G–C formam três ligações de hidrogênio e interações de empilhamento mais fortes que A–T (duas ligações), logo aumentam
(tornam a duplex mais estável) e reduzem ligeiramente
da transição, elevando
.
Passo 3
Uma estimativa prática muito usada é a regra “
–
” para oligonucleotídeos curtos:
ou ainda fórmulas que incluem
, por exemplo:
onde
é o comprimento em pares de bases.
Passo 4
Concluímos que, entre dois duplexes de mesmo tamanho, aquele com maior percentagem de pares G / C terá maior
de hibridização e, portanto, maior temperatura de fusão
.
Resposta
A Tm do DNA duplex determina-se seguindo a curva de absorbância a 260 nm em função da temperatura e tomando o ponto médio da transição (onde 50 % das fitas separem). Entre dois DNAs, aquele com maior percentagem de pares G / C possui maior temperatura de fusão, devido às três ligações de hidrogênio e ao empilhamento mais estável dessas bases em comparação com A–T.