Você deseja conduzir uma reação enzimática em
. Um amigo sugere um ácido fraco com pKa igual a 3,9 para o tampão. Esse ácido e sua base conjugada darão um bom tampão? Por quê? Como você resolveria este problema experimental?
Passo 1
O enunciado dá as seguintes informações e faz estas perguntas.
- Informação: quero conduzir uma reação enzimática em
. - Informação: um amigo sugere usar como tampão um ácido fraco cujo
(e sua base conjugada). - Perguntas: (1) esse par ácido/ base conjugada dará um bom tampão a
? (2) por quê? (3) como eu resolveria esse problema experimentalmente (isto é, o que eu usaria e como prepararia o tampão na prática)?
Passo 2
Conceitos essenciais (mini-aula): o que é tampão e a fórmula que usamos.
- Um tampão é uma solução que resiste a variações de
quando se adicionam pequenas quantidades de ácido ou base. Para tampões ácido/ base conjugada usamos a equação de Henderson–Hasselbalch:
onde
é a concentração da base conjugada e
é a concentração do ácido.
- Interpretação prática: quando
temos e a capacidade tampão é máxima (o tampão resiste bem tanto a adição de ácido quanto de base). Em termos práticos, um tampão é considerado eficaz aproximadamente quando ; fora disso a capacidade cai rapidamente.
Passo 3
Aplicando Henderson–Hasselbalch ao caso concreto para ver se o par sugerido funciona.
- Temos
e . Calculo a diferença:
- Reescrevo a fórmula para a razão
:
- Avaliando numericamente:
Isto significa que, para obter
com um ácido de
, eu precisaria de aproximadamente
vezes mais base conjugada do que ácido.
Passo 4
Interpretação do resultado anterior e argumento por que isso é impraticável como tampão.
- Um fator
quer dizer que a solução teria praticamente só a forma base e quase nada de . Quando a razão é tão grande: - A capacidade tampão é muito baixa contra a adição de base (pois já há excesso de base) e também ruim contra adição de ácido porque há tão pouco
disponível para neutralizar variações; em suma, não temos o balanço necessário para “amortecer” mudanças de . - Em termos práticos, a solução passa a comportar-se como uma simples solução do sal (a base conjugada) cuja
é ditada pela hidrólise da base, e pequenas adições de ácido/base mudam o com mais facilidade do que num tampão equilibrado.
- A capacidade tampão é muito baixa contra a adição de base (pois já há excesso de base) e também ruim contra adição de ácido porque há tão pouco
- Além disso, preparar uma solução com essa razão exige quantidades monstruosas de sal relativo ao ácido (problemas de custo), e pode aumentar muito a força iônica, afetar a enzima e até causar precipitação ou incompatibilidades.
Passo 5
Regra prática curta: quando o objetivo é
escolha um tampão cujo
esteja perto de
(idealmente dentro de ±1 unidade; melhor ainda se for perto de
unidade). O par com
está muito distante e portanto não é adequado.
Passo 6
Sugestões de tampões adequados e considerações enzimáticas (o que usar em vez do ácido com
).
- Tampões com
próximos de : - HEPES:
— excelente escolha para reações enzimáticas em . - Tampão fosfato (sistema
): — muito usado em bioquímica; bom se fosfato não interferir com a enzima. - MOPS:
— também uma opção. - Tris:
(sensible perto de 7,5, mas atenção forte dependência de temperatura).
- HEPES:
- Escolha baseada em: compatibilidade com a enzima (alguns tampões quelam íons, outros interferem com reações redox), dependência de temperatura, absorção UV, solubilidade, custo. Para muitas enzimas HEPES ou fosfato são boas primeiras escolhas; ver na literatura da enzima é sempre recomendado.
Passo 7
Como eu prepararia experimentalmente um tampão correto (passo a passo prático e dicas): exemplo genérico usando HEPES e um exemplo numérico com fosfato.
- Passos gerais:
- escolher a concentração total de tampão adequada (ex.:
– é comum para ensaios enzimáticos; escolha conforme necessidade de capacidade tampão e efeitos de força iônica). - pesar a forma ácida do tampão (ou usar soluções comerciais), dissolver em água destilada em volume menor que o final.
- ajustar o
lentamente com pequenas adições de (se precisar aumentar o ) ou (se precisar baixar), sob agitação. Ajustar o na mesma temperatura da reação (ou corrigir depois, pois alguns tampões têm variação com a temperatura). - completar o volume até o desejado, medir o
final e, se necessário, ajustar novamente. - filtrar (0,22 μm) ou autoclavar se necessário e armazenar conforme recomendações (alguns tampões escurecem ou degradam à luz).
- verificar compatibilidade com co-fatores/íons da enzima (ex.: se a enzima precisa de
ou , garantir que o tampão não quelará esses íons).
- escolher a concentração total de tampão adequada (ex.:
- Exemplo numérico rápido com tampão fosfato total
a : - Para fosfato o par relevante é
com . Use Henderson–Hasselbalch:
- Se a concentração total
então resolvo:
- Na prática, isso se consegue misturando volumes apropriados de soluções padrões de
e ou ajustando uma solução de com até .
- Para fosfato o par relevante é
- Exemplo simples com HEPES: como
, para a razão é (metade ácido, metade base), o que é muito conveniente — tipicamente dissolve-se a forma ácida e ajusta-se com NaOH até .
Passo 8
Outras dicas práticas e de segurança experimental (coisas que às vezes esquecemos):
- Meça e ajuste o
à temperatura da reação; tampões como Tris mudam bastante o com temperatura. - Controle a força iônica da solução (por exemplo adicionar
ou de NaCl se a enzima exigir). - Verifique se o tampão interfere com leituras espectrofotométricas ou com co-fatores (ex.: fosfato pode inibir algumas enzimas, HEPES pode reagir em reações redox sob luz).
- Faça um ensaio de atividade enzimática em pequenos volumes para confirmar que o tampão escolhido não inibe ou desnatura a enzima antes de preparar grandes volumes.
Passo 9
Resumo final da solução do problema (resposta direta e operacional):
- O par ácido/ base com
NÃO é uma boa escolha para tamponar a porque exigiria uma razão , ou seja praticamente só base e quase nenhum ácido — daí a capacidade tampão seria muito pobre e a preparação impraticável. - Em vez disso, escolha um tampão cujo
esteja perto de (ex.: HEPES , fosfato , MOPS, ou Tris com cuidado de temperatura) e prepare-o ajustando o conforme o procedimento prático descrito.
Resposta
Não — não darão um bom tampão. A razão
necessária para
com
é
, o que torna a capacidade tampão impraticável.
Como resolveria: escolher um tampão com próximo de
(por exemplo HEPES
ou tampão fosfato
), preparar a concentração desejada (ex.:
–
), ajustar o
com NaOH/HCl na temperatura de ensaio e checar compatibilidade do tampão com a enzima.
Como resolveria: escolher um tampão com