A hidrólise de pirofosfato a ortofosfato é importante para impulsionar reações de biossíntese, tais como a síntese de DNA. Esta reação hidrolítica é catalisada na Escherichia coli por uma pirofosfatase que tem uma massa de 120 kDa, constituída de seis subunidades idênticas. Para esta enzima, uma unidade de atividade e definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 10 \mu \mathrm{moles} de pirofosfato em 15 minutos, a 37^{\circ} \mathrm{C}, sob condições padrão de ensaio. A enzima purificada tem uma V_{\text {max }} de 2.800 unidades por miligrama de enzima.
(a) Quantos moles de substrato são hidrolisados por segundo por miligrama de enzima, quando a concentração de substrato é 20 vezes maior do que o valor de K_{\mathrm{M}} ?
(b) Quantos moles de centro ativo existem em 1 mg de enzima? Suponha que cada subunidade tenha um centro ativo.
(c) Qual é o número de renovação desta enzima?

Passo 1

O enunciado dá as seguintes informações e perguntas (vou listar tudo com calma para não nos perder):
  • A pirofosfatase tem massa total 120\\ \text{kDa} e consiste de seis subunidades idênticas.
  • Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 10\\ \mu\mathrm{mol} de pirofosfato em 15\\ \text{min} nas condições do ensaio.
  • A enzima purificada tem \,V_{\max}=2800\\ \text{unidades}\cdot\text{mg}^{-1}.
    As perguntas:
    (a) Quantos moles de substrato são hidrolisados por segundo por miligrama de enzima quando [S]=20K_M?
    (b) Quantos moles de centro ativo existem em 1\\ \text{mg} de enzima? (assuma um centro ativo por subunidade)
    (c) Qual é o número de renovação (turnover number, k_{\text{cat}}) dessa enzima?

Passo 2

Converter a definição de unidade para unidades do SI (mol por segundo).
Uma unidade = 10\\ \mu\mathrm{mol} em 15\\ \text{min}. Primeiro passo: transformar micromol em mol e minutos em segundos.
10\\ \mu\mathrm{mol} = 10\times 10^{-6}\\ \mathrm{mol} = 1{,}0\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol}
15\\ \text{min} = 15\times 60\\ \text{s} = 900\\ \text{s}
Logo a taxa correspondente a 1 unidade é
\text{1 unidade}=\frac{1{,}0\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol}}{900\\ \mathrm{s}}=1{,}111111\ldots\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}}.
Vou usar a forma exata repetida como 1{,}111111\!\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}} nas contas.

Passo 3

Converter V_{\max} de unidades por mg para mol·s{-1}·mg{-1}.
Dado \,V_{\max}=2800\\ \text{unidades}\cdot\text{mg}^{-1}, multiplicamos pelo valor de 1 unidade em mol/s:
V_{\max} = 2800\times 1{,}111111\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}.
Fazendo a multiplicação:
V_{\max}=3{,}111111\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}.
Interpretação: esse é o fluxo máximo de substrato (mol/s) que 1 mg da enzima pode processar quando totalmente saturada.

Passo 4

Calcular a velocidade quando [S]=20K_M usando a equação de Michaelis–Menten.
A equação de Michaelis–Menten é
v=\frac{V_{\max}[S]}{K_M+[S]},
onde v é a velocidade inicial, V_{\max} é o máximo e K_M é a constante de Michaelis. Substituindo [S]=20K_M:
v=\frac{V_{\max}\cdot 20K_M}{K_M+20K_M}=\frac{20}{21}V_{\max}.
Agora aplicamos o V_{\max} em mol·s{-1}·mg{-1} calculado no Passo 3:
v=\frac{20}{21}\times 3{,}111111\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}.
Fazendo a conta:
v=2{,}962962\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}.
Interpretação numérica simples: quando [S]=20K_M a velocidade está em aproximadamente 95{,}24\% de V_{\max}.

Passo 5

Calcular quantos moles de centro ativo existem em 1\\ \text{mg} de enzima (parte (b)).
Primeiro obtenho quantos moles de moléculas enzimáticas há em 1\\ \text{mg}. A massa molar da enzima (uma molécula completa, hexâmero) é 120\\ \text{kDa}=120000\\ \mathrm{g\\ mol^{-1}}. Então:
\text{mols de enzima em }1\\ \mathrm{mg}=\frac{1{,}0\times 10^{-3}\\ \mathrm{g}}{120000\\ \mathrm{g\\ mol^{-1}}}=8{,}333333\times 10^{-9}\\ \mathrm{mol}.
Cada molécula tem 6 subunidades e assumimos 1 centro ativo por subunidade, logo moles de centros ativos:
\text{mols de centros ativos}=6\times 8{,}333333\times 10^{-9}=5{,}0\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol}.
Portanto, em 1\\ \text{mg} de enzima há 5{,}0\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol} de centros ativos. (Se quiser o número absoluto de sítios: multiplicar por N_A\approx 6{,}022\times 10^{23} dá aproximadamente 3{,}01\times 10^{16} sítios.)

Passo 6

Calcular o número de renovação k_{\text{cat}} (parte (c)). Definição e cálculo.
Definição: k_{\text{cat}} é o número de moléculas de substrato convertidas por centro ativo por segundo quando a enzima está saturada; numericamente,
k_{\text{cat}}=\frac{V_{\max}\\ (\text{em mol·s}^{-1}\\ \text{por mg})}{\text{mols de centros ativos por mg}}.
Usando os valores já obtidos:
k_{\text{cat}}=\frac{3{,}111111\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}}{5{,}0\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol\\ centros\\ ativos\\ mg^{-1}}}.
Fazendo a divisão:
k_{\text{cat}}=6{,}22222\times 10^{2}\\ \mathrm{s^{-1}}\approx 6{,}22\times 10^{2}\\ \mathrm{s^{-1}}.
Interpretação: cada centro ativo converte, em condição de saturação, cerca de 622 moléculas de substrato por segundo.

Resposta

(a) \;2{,}962962\times 10^{-5}\\ \mathrm{mol\\ s^{-1}\\ mg^{-1}}
(b) \;5{,}0\times 10^{-8}\\ \mathrm{mol\\ de\\ centros\\ ativos\\ em\\\ 1\\ mg}
(c) \;6{,}22\times 10^{2}\\ \mathrm{s^{-1}}

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