(2.0 Pontos) Você recebeu 10 compostos para testar se eles interagem com a sua proteína e decidiu utilizar a RMN para esse propósito. Proponha uma estratégia experimental, informando os detalhes: tipo de amostra, átomo a ser analisado e possíveis experimentos a serem executados.
Passo 1
O enunciado pede uma estratégia de triagem por RMN para identificar quais dos 10 compostos ligam à proteína alvo. O conteúdo é espectroscopia de ressonância magnética nuclear aplicada a interações proteína-ligante. Precisamos definir o tipo de amostra (protein-detected ou ligand-detected), qual núcleo observar e que experimentos empregaremos para evidenciar a ligação.
Passo 2
Preparação da amostra: expressar a proteína em meio enriquecido com
(ou
se for alto peso molecular) e purificá-la em tampão de RMN (por exemplo 20 mM fosfato, pH 6,5, 10 %
, 0,02 %
). Ajustar
. Preparar soluções dos 10 compostos em
-d
e adicionar cada um em excesso molar (relação ligante:proteína de
) ou em misturas de 3–4 ligantes para agilizar a triagem, garantindo que o
final não passe de 2 %.
Passo 3
Experimentos ligand-detected (
ou
, caso haja fluoretos):
– 1D STD-NMR (saturation transfer difference): saturar sinais proteicos e detectar sinais de ligante que recebem transferência de saturação, indicando contato próximo.
– WaterLOGSY: observar inversão de sinal de ligantes que trocam NOE com água mediada pela proteína.
– CPMG-relaxation-filtered: comparar espectros com e sem filtro CPMG; diminuição de intensidade aponta interação com o macromolecular.
– 1D STD-NMR (saturation transfer difference): saturar sinais proteicos e detectar sinais de ligante que recebem transferência de saturação, indicando contato próximo.
– WaterLOGSY: observar inversão de sinal de ligantes que trocam NOE com água mediada pela proteína.
– CPMG-relaxation-filtered: comparar espectros com e sem filtro CPMG; diminuição de intensidade aponta interação com o macromolecular.
Passo 4
Experimentos protein-detected
-
HSQC ou TROSY-HSQC para proteínas grandes): adquirir espectro de referência da proteína livre e, em seguida, repetir após adição de cada ligante (ou mistura). Monitorar deslocamentos químicos (
de picos no HSQC. Perturbações específicas revelam resíduos de ligação e afinidade relativa.
Resposta
Em resumo, montar amostras com proteína
marcada a
em tampão de RMN, adicionar ligantes (isolados ou em pool) em excesso 10:1 e realizar:
- Ligand-detected (núcleo
ou ): 1D STD, WaterLOGSY e CPMG. - Protein-detected: 2D
- HSQC (ou TROSY).
Ligantes que mostrarem sinais em STD/WaterLOGSY e causaremno HSQC são marcadores de interação.