(2.0 Pontos) Você recebeu 10 compostos para testar se eles interagem com a sua proteína e decidiu utilizar a RMN para esse propósito. Proponha uma estratégia experimental, informando os detalhes: tipo de amostra, átomo a ser analisado e possíveis experimentos a serem executados.

Passo 1

O enunciado pede uma estratégia de triagem por RMN para identificar quais dos 10 compostos ligam à proteína alvo. O conteúdo é espectroscopia de ressonância magnética nuclear aplicada a interações proteína-ligante. Precisamos definir o tipo de amostra (protein-detected ou ligand-detected), qual núcleo observar e que experimentos empregaremos para evidenciar a ligação.

Passo 2

Preparação da amostra: expressar a proteína em meio enriquecido com ^\mathrm{15}\mathrm{N} (ou ^\mathrm{13}\mathrm{C},^\mathrm{15}\mathrm{N} se for alto peso molecular) e purificá-la em tampão de RMN (por exemplo 20 mM fosfato, pH 6,5, 10 % \mathrm{D_2O}, 0,02 % \mathrm{NaN_3}). Ajustar [\text{proteína}]\approx50\text{–}100 \mu\mathrm{M}í. Preparar soluções dos 10 compostos em \mathrm{DMSO}-d _6 e adicionar cada um em excesso molar (relação ligante:proteína de \sim10\!:\!1) ou em misturas de 3–4 ligantes para agilizar a triagem, garantindo que o \mathrm{DMSO} final não passe de 2 %.

Passo 3

Experimentos ligand-detected ( ^{1}\mathrm{H} ou ^{19}\mathrm{F}, caso haja fluoretos):
– 1D STD-NMR (saturation transfer difference): saturar sinais proteicos e detectar sinais de ligante que recebem transferência de saturação, indicando contato próximo.
– WaterLOGSY: observar inversão de sinal de ligantes que trocam NOE com água mediada pela proteína.
– CPMG-relaxation-filtered: comparar espectros com e sem filtro CPMG; diminuição de intensidade aponta interação com o macromolecular.

Passo 4

Experimentos protein-detected ^1\mathrm{H}- ^15\mathrm{N} HSQC ou TROSY-HSQC para proteínas grandes): adquirir espectro de referência da proteína livre e, em seguida, repetir após adição de cada ligante (ou mistura). Monitorar deslocamentos químicos ( \Delta\delta de picos no HSQC. Perturbações específicas revelam resíduos de ligação e afinidade relativa.

Resposta

Em resumo, montar amostras com proteína ^\mathrm{15}\mathrm{N} marcada a \sim100 \mu\mathrm{M} em tampão de RMN, adicionar ligantes (isolados ou em pool) em excesso 10:1 e realizar:
  1. Ligand-detected (núcleo ^1\mathrm{H} ou ^19\mathrm{F}): 1D STD, WaterLOGSY e CPMG.
  2. Protein-detected: 2D ^1\mathrm{H}- ^15\mathrm{N} HSQC (ou TROSY).
    Ligantes que mostrarem sinais em STD/WaterLOGSY e causarem \Delta\delta no HSQC são marcadores de interação.

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