Problema de HPLC: Mistura de Compostos Não Conseguindo Ser Separada
Cenário: Você está realizando uma análise em HPLC para separar uma mistura de compostos Ae B, ambos com estruturas químicas muito semelhantes. A amostra foi injetada em uma coluna C18 e uma fase móvel composta por 60% de água e 40% de metanol. A temperatura foi mantida em 25^circ C e o fluxo da fase móvel está ajustado para 1,0 mL / min. No entanto, ao observar o cromatograma, você nota que os dois compostos aparecem como um único pico, o que indica que não houve separação eficaz entre os dois compostos.
Qual é a principal razão para a falha na separação dos compostos A e B no cromatograma? Justifique sua resposta.

Passo 1

Beleza, o enunciado diz que você injetou uma mistura de dois compostos A e B numa coluna C18 (fase reversa) usando 60% água/40% metanol, 25 °C e 1,0 mL/min. No cromatograma eles saíram juntos num único pico, ou seja, não separaram. O conteúdo aqui é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em particular fase reversa, e o que precisamos entender é por que A e B têm o mesmo tempo de retenção.

Passo 2

Antes de tudo, lembra que em fase reversa a retenção de uma molécula depende de quão “hidrofóbica” ela é. Quanto mais hidrofóbica, mais tempo ela fica grudada na fase fixa C18 e mais atrasado aparece no detector. A gente costuma usar o fator de retenção
k = tR - t0t0
onde
- é o tempo de retenção do composto,
- é o tempo morto (quando uma molécula não retida sai).

Passo 3

Para dois picos serem separados, a diferença nos tempos de retenção Rs approx 2,(tR,B-tR,A)wA + wB (ou naqueles fatores ) tem que ser grande o suficiente. A resolução entre dois picos vale aproximadamente

onde e são larguras dos picos. Se e são quase iguais, fica muito pequena e , ou seja, eles coeluem.

Passo 4

No caso, A e B têm estruturas muito semelhantes, o que implica que:
  1. Elas têm praticamente o mesmo coeficiente de partição entre fase móvel e fixa.
  2. Consequentemente, seus fatores de retenção e são praticamente idênticos.
Como resultado, e você vê só um pico.

Resposta

A principal razão da falha é que A e B têm afinidades muito parecidas pela fase estacionária C18 (e pela fase móvel de 60/40 água/metanol), logo seus tempos de retenção são quase idênticos, gerando coeluição em um único pico.

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