Problema de HPLC: Mistura de Compostos Não Conseguindo Ser Separada
Cenário: Você está realizando uma análise em HPLC para separar uma mistura de compostos Ae B, ambos com estruturas químicas muito semelhantes. A amostra foi injetada em uma coluna C18 e uma fase móvel composta por
de água e
de metanol. A temperatura foi mantida em
e o fluxo da fase móvel está ajustado para
. No entanto, ao observar o cromatograma, você nota que os dois compostos aparecem como um único pico, o que indica que não houve separação eficaz entre os dois compostos.
Qual é a principal razão para a falha na separação dos compostos
e
no cromatograma? Justifique sua resposta.
Cenário: Você está realizando uma análise em HPLC para separar uma mistura de compostos Ae B, ambos com estruturas químicas muito semelhantes. A amostra foi injetada em uma coluna C18 e uma fase móvel composta por
Qual é a principal razão para a falha na separação dos compostos
Passo 1
Beleza, o enunciado diz que você injetou uma mistura de dois compostos A e B numa coluna C18 (fase reversa) usando 60% água/40% metanol, 25 °C e 1,0 mL/min. No cromatograma eles saíram juntos num único pico, ou seja, não separaram. O conteúdo aqui é cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em particular fase reversa, e o que precisamos entender é por que A e B têm o mesmo tempo de retenção.
Passo 2
Antes de tudo, lembra que em fase reversa a retenção de uma molécula depende de quão “hidrofóbica” ela é. Quanto mais hidrofóbica, mais tempo ela fica grudada na fase fixa C18 e mais atrasado aparece no detector. A gente costuma usar o fator de retenção
onde
-
-
Passo 3
Para dois picos serem separados, a diferença nos tempos de retenção
(ou naqueles fatores
) tem que ser grande o suficiente. A resolução
entre dois picos vale aproximadamente
onde
Passo 4
No caso, A e B têm estruturas muito semelhantes, o que implica que:
- Elas têm praticamente o mesmo coeficiente de partição entre fase móvel e fixa.
- Consequentemente, seus fatores de retenção
e são praticamente idênticos.
Como resultado,
e você vê só um pico.
Resposta
A principal razão da falha é que A e B têm afinidades muito parecidas pela fase estacionária C18 (e pela fase móvel de 60/40 água/metanol), logo seus tempos de retenção são quase idênticos, gerando coeluição em um único pico.