Questão 5. Indique qual técnica ou método você utilizaria para atingir cada objetivo a seguir.
Estudar mudanças conformacionais em um complexo proteico.
Estudar mudanças conformacionais em um complexo proteico.
Passo 1
O enunciado pede uma técnica para estudar mudanças conformacionais em um complexo proteico; isso requer um método que monitore variações de distância intramolecular na faixa de poucos nanômetros e consiga captar dinâmicas em tempo real.
Passo 2
Uma excelente escolha é a espectroscopia de transferência de energia por ressonância de Förster em única-molécula (smFRET), pois ela resolve distâncias de
a
nm e acompanha mudanças conformacionais ao longo do tempo.
Passo 3
O princípio do smFRET é rotular dois sítios da proteína com um fluoróforo doador e um aceitador; a eficiência de transferência de energia depende da distância
entre eles segundo
onde
é o raio de Förster (geralmente
nm).
Passo 4
No experimento prepara-se a proteína com aminoácidos mutantes contendo grupos reativos para marcação, fixa-se a molécula em superfície ou em vesícula, excita-se o doador em microscópio de fluorescência de TIRF, registra-se as intensidades do doador e do aceitador para cada molécula e converte-se em distâncias e populações conformacionais ao longo do tempo.
Resposta
smFRET (single-molecule Förster Resonance Energy Transfer)