QUESTÃO 1: Em seu laboratório você pode fazer troca iónica usando diferentes meios, que são pomstitídos de pequeníssimas contas de um polímero cujas superficies são revestidas de grupamentos iônicos, tais como dietil-aminoctil (DEAE) ou carboximetil (CM).
a) DEAE
b) CM
São escolhidas condições em que a substância desejada liga-se ao meio da troca iônica, mas não as não desejadas. Você escolheria meios contendo DEAE ou CM para tentar separar o peptídeo abaixo de uma mistura de diferentes peptídeos, a pH 7,0 ?
Como faria para eleuir o peptídeo de interesse da coluna?
Este peptídeo tem um PI menor ou maior que 7 ?
Explique as bases das suas respostas
GLEKSLVRLGDVQPSLGKESRAKKFQRQ
a) DEAE
b) CM
Como faria para eleuir o peptídeo de interesse da coluna?
Este peptídeo tem um PI menor ou maior que 7 ?
Explique as bases das suas respostas
Passo 1
O que o enunciado pede e o que temos disponível (lista clara):
- Perguntas a responder:
- Escolher entre meios contendo DEAE ou CM para separar o peptídeo a pH
. - Explicar como eluir (desprender) o peptídeo de interesse da coluna.
- Dizer se o peptídeo tem o ponto isoelétrico (pI) menor ou maior que
e explicar a base dessa resposta.
- Escolher entre meios contendo DEAE ou CM para separar o peptídeo a pH
- Informações fornecidas:
- Grupo DEAE, cuja fórmula dada é
. Isso mostra que o grupo está protonado/positivo (carga ). - Grupo CM, representado por
. Isso mostra carga negativa ( ). - pH do experimento:
. - Sequência do peptídeo:
.
- Grupo DEAE, cuja fórmula dada é
Passo 2
Breve explicação física-química necessária (como raciocinar em prova):
- Interação de troca iônica: cargas opostas atraem. Um resino com cargas positivas retém espécies negativas; um resino com cargas negativas retém espécies positivas.
- Portanto:
- DEAE (grupo carregado positivamente) é um trocador aniônico: retém ânions (espécies carregadas negativamente).
- CM (grupo carregado negativamente) é um trocador catiônico: retém cátions (espécies carregadas positivamente).
- Para decidir qual resina usar, é preciso saber se o peptídeo está carregado positivamente ou negativamente a pH
.
Passo 3
Quais grupos ionizáveis há no peptídeo e as pKa típicas que vamos usar (explicando o que significa pKa):
- Grupos que contribuem carga no peptídeo:
- Terminais: amino N-terminal (pKa aproximada
) e carboxila C-terminal (pKa aproximada ). - Cadeias laterais ionizáveis presentes na sequência:
- Ácido aspártico (Asp,
), pKa (quando está desprotonado e com carga ). - Ácido glutâmico (Glu,
), pKa . - Lisina (Lys,
), pKa (quando está protonada e com carga ). - Arginina (Arg,
), pKa .
- Ácido aspártico (Asp,
- Terminais: amino N-terminal (pKa aproximada
- Interpretação prática da pKa:
- Se
de um grupo ácido, ele está majoritariamente desprotonado (carga negativa). - Se
de um grupo básico, ele está majoritariamente protonado (carga positiva).
- Se
Passo 4
Contagem explícita dos resíduos carregados na sequência (vou listar e contar):
- Sequência (posições):
(comprimento resíduos). - Contagem dos resíduos ionizáveis:
-
(Asp): ocorrência (posição 11). -
(Glu): ocorrências (posições 3 e 19). -
(Lys): ocorrências (posições 4, 18, 23, 24). -
(Arg): ocorrências (posições 8, 21, 27).
-
- Terminais:
- N-terminal:
quando protonado (pKa ). - C-terminal:
quando desprotonado (pKa ).
- N-terminal:
Passo 5
Cálculo passo a passo da carga líquida do peptídeo a
(explicando cada contribuição)
- A pH
as condições típicas são: - Asp e Glu (pKa
e ) estarão desprotonados cada um contribui com . - Lys e Arg (pKa
e ) estarão protonados cada um contribui com . - N-terminal (
) está majoritariamente protonado a pH . - C-terminal (
) está desprotonado a pH .
- Asp e Glu (pKa
- Agora somamos:
- Cargas positivas das cadeias laterais básicas:
Lys Arg cargas positivas . - Cargas negativas das cadeias laterais ácidas:
Asp Glu cargas negativas . - Terminais: N-term
, C-term .
- Cargas positivas das cadeias laterais básicas:
- Fórmula e cálculo:
- Conclusão desta etapa: o peptídeo tem carga líquida
a pH ; ou seja, é catiônico (positivamente carregado).
Passo 6
Conclusão sobre qual meio escolher (resumo e justificativa prática)
- Como o peptídeo está positivamente carregado a pH
, ele será retido por um trocador catiônico (resina com cargas negativas). - Dado que CM tem grupo
(carga negativa), escolha: meio contendo . - Justificativa curta e direta: cargas opostas atraem — CM (negativo) retém peptídeos positivos; DEAE (positivo) retém peptídeos negativos, portanto DEAE não é adequado para este peptídeo em pH
.
Passo 7
Como eluir (procedimento prático e por quê funciona — enfoque didático)
- Principais estratégias de eluição em cromatografia de troca iônica:
- Eluir por competição iônica (método mais usado/prático): aplicar um gradiente de sal (por exemplo, NaCl) no mesmo tampão. Os cátions salinos (
ou ) competem com o peptídeo pelos sítios carregados na resina e, aumentando a força iônica, deslocam o peptídeo para a fase móvel. - Procedimento típico: ligar a coluna em tampão a pH
com baixa força iônica (por ex. mM de tampão), depois aplicar um gradiente linear de a NaCl e coletar frações; monitorar proteína/peptídeo por absorbância a nm ou outro ensaio. - Por que é bom na prova: é robusto, mantém pH e estrutura, e funciona sem precisar alterar pH drasticamente.
- Procedimento típico: ligar a coluna em tampão a pH
- Eluir por mudança de pH: alterar o pH do tampão para modificar o estado de protonação do peptídeo (se pH ultrapassar o pI, a carga do peptídeo muda e ele deixa de ser fortemente retido).
- No entanto, para este peptídeo há muitos resíduos básicos com pKa altos (Lys
, Arg ), então elevar o pH até descarregar suficientemente o peptídeo exigiria pH muito alcalino, o que pode denaturar a amostra ou a resina. Portanto, esta rota é menos prática aqui.
- No entanto, para este peptídeo há muitos resíduos básicos com pKa altos (Lys
- Eluir por competição iônica (método mais usado/prático): aplicar um gradiente de sal (por exemplo, NaCl) no mesmo tampão. Os cátions salinos (
- Conclusão prática: eluir por gradiente de sal (NaCl) é a escolha recomendada; mudança de pH é teoricamente possível, mas impraticável neste caso devido ao pI alto.
Passo 8
Discussão sobre o pI do peptídeo e estimativa numérica (como estimar em prova)
- Definição: pI é o pH no qual a carga líquida do peptídeo é zero.
- Observação a partir do cálculo da carga a pH
: o peptídeo tem carga , portanto o pI deve ser . - Estimativa rápida do pI por raciocínio dos pKa dominantes:
- Subimos o pH a partir de
: o primeiro grupo básico a perder próton é o N-terminal (pKa ), depois as lisinas (cada Lys pKa ), e as argininas têm pKa ainda maiores ( ). - Para neutralizar a carga
observada a pH , é preciso desprotonar aproximadamente o N-terminal ( ) mais cerca de três lisinas (cada ). Portanto o ponto onde a carga passa por zero fica na região das pKa das lisinas.
- Subimos o pH a partir de
- Estimativa numérica simples:
- Por esse raciocínio, uma estimativa razoável é
(na prática um cálculo mais preciso de pI exigiria somar contribuições fracionárias com as pKa individuais, mas para prova essa aproximação é aceitável).
- Por esse raciocínio, uma estimativa razoável é
- Conclusão: o peptídeo tem
maior que ; estimativa prática .
Passo 9
Resumo prático final e dica de prova (motivação)
- Resumindo para a prova: conte as cargas, some positivos e negativos incluindo terminais, compare com pH experimental e escolha a resina com carga oposta ao peptídeo naquele pH; para eluir, prefira gradiente de sal quando pI for alto.
- Você já fez a maior parte do trabalho mental da prova: contar resíduos e aplicar as regras de pKa. Isso é suficiente para justificar a escolha e o método de eluição. Força aí — você consegue!
Resposta
CM
Eluição por gradiente de sal (por exemplo, aumento de na mesma tampão); alternativa teórica: aumentar o pH acima do pI (praticamente pouco aconselhável aqui).
O peptídeo tem pI maior que ; estimativa
.
Eluição por gradiente de sal (por exemplo, aumento de
O peptídeo tem pI maior que