QUESTÃO 1: Em seu laboratório você pode fazer troca iónica usando diferentes meios, que são pomstitídos de pequeníssimas contas de um polímero cujas superficies são revestidas de grupamentos iônicos, tais como dietil-aminoctil (DEAE) ou carboximetil (CM).
a) DEAE
-\left(\mathrm{CH}_{2}\right)_{2}-\mathrm{N}^{+} \mathrm{H}-\left(\mathrm{CH}_{2}-\mathrm{CH}_{3}\right)_{2}
b) CM
-\mathrm{CH}_{2}-\mathrm{COO}^{-}
São escolhidas condições em que a substância desejada liga-se ao meio da troca iônica, mas não as não desejadas. Você escolheria meios contendo DEAE ou CM para tentar separar o peptídeo abaixo de uma mistura de diferentes peptídeos, a pH 7,0 ?
Como faria para eleuir o peptídeo de interesse da coluna?
Este peptídeo tem um PI menor ou maior que 7 ?
Explique as bases das suas respostas

GLEKSLVRLGDVQPSLGKESRAKKFQRQ

Passo 1

O que o enunciado pede e o que temos disponível (lista clara):
  • Perguntas a responder:
    1. Escolher entre meios contendo DEAE ou CM para separar o peptídeo a pH 7{,}0.
    2. Explicar como eluir (desprender) o peptídeo de interesse da coluna.
    3. Dizer se o peptídeo tem o ponto isoelétrico (pI) menor ou maior que 7 e explicar a base dessa resposta.
  • Informações fornecidas:
    • Grupo DEAE, cuja fórmula dada é -\left(\mathrm{CH}_{2}\right)_{2}-\mathrm{N}^{+}\mathrm{H}-\left(\mathrm{CH}_{2}-\mathrm{CH}_{3}\right)_{2}. Isso mostra que o grupo está protonado/positivo (carga \,+).
    • Grupo CM, representado por -\mathrm{CH}_{2}-\mathrm{COO}^{-}. Isso mostra carga negativa ( \,-).
    • pH do experimento: 7{,}0.
    • Sequência do peptídeo: \mathrm{GLEKSLVRLGDVQPSLGKESRAKKFQRQ}.

Passo 2

Breve explicação física-química necessária (como raciocinar em prova):
  • Interação de troca iônica: cargas opostas atraem. Um resino com cargas positivas retém espécies negativas; um resino com cargas negativas retém espécies positivas.
  • Portanto:
    • DEAE (grupo carregado positivamente) é um trocador aniônico: retém ânions (espécies carregadas negativamente).
    • CM (grupo carregado negativamente) é um trocador catiônico: retém cátions (espécies carregadas positivamente).
  • Para decidir qual resina usar, é preciso saber se o peptídeo está carregado positivamente ou negativamente a pH 7{,}0.

Passo 3

Quais grupos ionizáveis há no peptídeo e as pKa típicas que vamos usar (explicando o que significa pKa):
  • Grupos que contribuem carga no peptídeo:
    • Terminais: amino N-terminal (pKa aproximada \approx 8{,}0) e carboxila C-terminal (pKa aproximada \approx 3{,}1).
    • Cadeias laterais ionizáveis presentes na sequência:
      • Ácido aspártico (Asp, \mathrm{D}), pKa \approx 3{,}9 (quando \mathrm{pH}>\mathrm{pKa} está desprotonado e com carga -1).
      • Ácido glutâmico (Glu, \mathrm{E}), pKa \approx 4{,}1.
      • Lisina (Lys, \mathrm{K}), pKa \approx 10{,}5 (quando \mathrm{pH}<\mathrm{pKa} está protonada e com carga +1).
      • Arginina (Arg, \mathrm{R}), pKa \approx 12{,}5.
  • Interpretação prática da pKa:
    • Se \mathrm{pH} > \mathrm{pKa} de um grupo ácido, ele está majoritariamente desprotonado (carga negativa).
    • Se \mathrm{pH} < \mathrm{pKa} de um grupo básico, ele está majoritariamente protonado (carga positiva).

Passo 4

Contagem explícita dos resíduos carregados na sequência (vou listar e contar):
  • Sequência (posições): \mathrm{GLEKSLVRLGDVQPSLGKESRAKKFQRQ} (comprimento 28 resíduos).
  • Contagem dos resíduos ionizáveis:
    • \mathrm{D} (Asp): 1 ocorrência (posição 11).
    • \mathrm{E} (Glu): 2 ocorrências (posições 3 e 19).
    • \mathrm{K} (Lys): 4 ocorrências (posições 4, 18, 23, 24).
    • \mathrm{R} (Arg): 3 ocorrências (posições 8, 21, 27).
  • Terminais:
    • N-terminal: +1 quando protonado (pKa \approx 8{,}0).
    • C-terminal: -1 quando desprotonado (pKa \approx 3{,}1).

Passo 5

Cálculo passo a passo da carga líquida do peptídeo a \mathrm{pH}=7{,}0 (explicando cada contribuição)
  • A pH 7{,}0 as condições típicas são:
    • Asp e Glu (pKa \approx 3{,}9 e 4{,}1) estarão desprotonados \Rightarrow cada um contribui com -1.
    • Lys e Arg (pKa 10{,}5 e 12{,}5) estarão protonados \Rightarrow cada um contribui com +1.
    • N-terminal ( \mathrm{pKa}\approx 8{,}0) está majoritariamente protonado a pH 7{,}0 \Rightarrow +1.
    • C-terminal ( \mathrm{pKa}\approx 3{,}1) está desprotonado a pH 7{,}0 \Rightarrow -1.
  • Agora somamos:
    • Cargas positivas das cadeias laterais básicas: 4 Lys + 3 Arg =\;7 cargas positivas \Rightarrow +7.
    • Cargas negativas das cadeias laterais ácidas: 1 Asp + 2 Glu =\;3 cargas negativas \Rightarrow -3.
    • Terminais: N-term +1, C-term -1.
  • Fórmula e cálculo: \text{carga líquida} = (+7) + (+1) + (-3) + (-1) = +4.í
  • Conclusão desta etapa: o peptídeo tem carga líquida \mathbf{+4} a pH 7{,}0; ou seja, é catiônico (positivamente carregado).

Passo 6

Conclusão sobre qual meio escolher (resumo e justificativa prática)
  • Como o peptídeo está positivamente carregado a pH 7{,}0, ele será retido por um trocador catiônico (resina com cargas negativas).
  • Dado que CM tem grupo -\mathrm{COO}^{-} (carga negativa), escolha: meio contendo \mathbf{CM}.
  • Justificativa curta e direta: cargas opostas atraem — CM (negativo) retém peptídeos positivos; DEAE (positivo) retém peptídeos negativos, portanto DEAE não é adequado para este peptídeo em pH 7.

Passo 7

Como eluir (procedimento prático e por quê funciona — enfoque didático)
  • Principais estratégias de eluição em cromatografia de troca iônica:
    1. Eluir por competição iônica (método mais usado/prático): aplicar um gradiente de sal (por exemplo, NaCl) no mesmo tampão. Os cátions salinos ( \mathrm{Na}^{+} ou \mathrm{K}^{+}) competem com o peptídeo pelos sítios carregados na resina e, aumentando a força iônica, deslocam o peptídeo para a fase móvel.
      • Procedimento típico: ligar a coluna em tampão a pH 7{,}0 com baixa força iônica (por ex. 20 mM de tampão), depois aplicar um gradiente linear de 0 a 1{,}0\\ \mathrm{M} NaCl e coletar frações; monitorar proteína/peptídeo por absorbância a 280 nm ou outro ensaio.
      • Por que é bom na prova: é robusto, mantém pH e estrutura, e funciona sem precisar alterar pH drasticamente.
    2. Eluir por mudança de pH: alterar o pH do tampão para modificar o estado de protonação do peptídeo (se pH ultrapassar o pI, a carga do peptídeo muda e ele deixa de ser fortemente retido).
      • No entanto, para este peptídeo há muitos resíduos básicos com pKa altos (Lys \approx10{,}5, Arg \approx12{,}5), então elevar o pH até descarregar suficientemente o peptídeo exigiria pH muito alcalino, o que pode denaturar a amostra ou a resina. Portanto, esta rota é menos prática aqui.
  • Conclusão prática: eluir por gradiente de sal (NaCl) é a escolha recomendada; mudança de pH é teoricamente possível, mas impraticável neste caso devido ao pI alto.

Passo 8

Discussão sobre o pI do peptídeo e estimativa numérica (como estimar em prova)
  • Definição: pI é o pH no qual a carga líquida do peptídeo é zero.
  • Observação a partir do cálculo da carga a pH 7{,}0: o peptídeo tem carga +4, portanto o pI deve ser \mathbf{maior\\ que\\\ 7}.
  • Estimativa rápida do pI por raciocínio dos pKa dominantes:
    • Subimos o pH a partir de 7: o primeiro grupo básico a perder próton é o N-terminal (pKa \approx 8{,}0), depois as lisinas (cada Lys pKa \approx 10{,}5), e as argininas têm pKa ainda maiores ( \approx 12{,}5).
    • Para neutralizar a carga +4 observada a pH 7, é preciso desprotonar aproximadamente o N-terminal ( \sim 8{,}0) mais cerca de três lisinas (cada \sim 10{,}5). Portanto o ponto onde a carga passa por zero fica na região das pKa das lisinas.
  • Estimativa numérica simples:
    • Por esse raciocínio, uma estimativa razoável é \mathrm{pI}\approx 10{,}5 (na prática um cálculo mais preciso de pI exigiria somar contribuições fracionárias com as pKa individuais, mas para prova essa aproximação é aceitável).
  • Conclusão: o peptídeo tem \mathrm{pI} maior que 7; estimativa prática \mathrm{pI}\approx 10{,}5.

Passo 9

Resumo prático final e dica de prova (motivação)
  • Resumindo para a prova: conte as cargas, some positivos e negativos incluindo terminais, compare com pH experimental e escolha a resina com carga oposta ao peptídeo naquele pH; para eluir, prefira gradiente de sal quando pI for alto.
  • Você já fez a maior parte do trabalho mental da prova: contar resíduos e aplicar as regras de pKa. Isso é suficiente para justificar a escolha e o método de eluição. Força aí — você consegue!

Resposta

CM
Eluição por gradiente de sal (por exemplo, aumento de \mathrm{NaCl} na mesma tampão); alternativa teórica: aumentar o pH acima do pI (praticamente pouco aconselhável aqui).
O peptídeo tem pI maior que 7; estimativa \mathrm{pI}\approx 10{,}5.

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