Estime os valores de V_{m x} e k_{m} da reação catalisada por uma enzima na qual foram obtidos os dados da tabela abaixo. Comente possíveis diferenças entre os métodos.
\mathbf{[ S ] ( M )} \mathbf{V}_{\mathbf{o}}(\boldsymbol{\mu} \mathbf{M} / \mathbf{m i n})
2,5 \times 10^{-6} 28
4 \times 10^{-6} 40
1 \times 10^{-5} 70
2 \times 10^{-5} 95
4 \times 10^{-5} 112
1 \times 10^{-4} 128
2 \times 10^{-3} 139
1 \times 10^{-2} 140
2 \times 10^{-1} 140
b) Pelo método de Eadie Hosftee

Passo 1

O enunciado pede que eu estime os valores de V_{m} (máxima velocidade) e k_{m} (constante de Michaelis) para a reação enzimática a partir dos dados experimentais da tabela, e que faça isso pelo método de Eadie–Hofstee (item b).
Dados fornecidos (peguei diretamente da tabela do enunciado):
\begin{array}{cc} \,[S]\\ (\mathrm{M}) & V_{o}\\ (\mu\mathrm{M}/\mathrm{min})\\hline 2{,}5\times10^{-6} & 28\\\\ 4\times10^{-6} & 40\\\\ 1\times10^{-5} & 70\\\\ 2\times10^{-5} & 95\\\\ 4\times10^{-5} & 112\\\\ 1\times10^{-4} & 128\\\\ 2\times10^{-3} & 139\\\\ 1\times10^{-2} & 140\\\\ 2\times10^{-1} & 140 \end{array}
Perguntas claras:
  1. Estimar V_{m} e k_{m} usando o método de Eadie–Hofstee.
  2. Comentar possíveis diferenças entre métodos (por exemplo, Eadie–Hofstee vs outras linearizações e vs ajuste não-linear).

Passo 2

Breve explicação didática do método (sem pular etapas).
A equação de Michaelis–Menten é
V_{o}=\frac{V_{m}[S]}{K_{m}+[S]},
onde:
  • V_{o} é a velocidade inicial medida ( \mu\mathrm{M}/\mathrm{min} aqui),
  • [S] é a concentração de substrato (unidades de concentração),
  • V_{m} é a velocidade máxima (quando a enzima está saturada),
  • K_{m} é a constante de Michaelis (concentração de substrato na qual V_{o}=V_{m}/2).
O método de Eadie–Hofstee consiste em rearranjar a equação para uma forma linear. Fazendo algebra:
V_{o}=\frac{V_{m}[S]}{K_{m}+[S]} \quad\Longrightarrow\quad \frac{V_{o}}{[S]}=\frac{V_{m}}{K_{m}+[S]}
mas a forma usada tradicionalmente é:
V_{o}=V_{m}-K_{m}\left(\frac{V_{o}}{[S]}\right).
Essa é uma equação da reta y = b + m x escrita como
y = V_{o},\quad x=\frac{V_{o}}{[S]},\quad \text{slope } m = -K_{m},\quad \text{intercept } b = V_{m}.
Ou seja: ao plotar V_{o} (ordinada) versus V_{o}/[S] (abscissa) obtemos uma reta cuja inclinação é -K_{m} e cujo intercepto em y é V_{m}. Importante notar (explicação didática): aqui a variável x contém V_{o}, que tem erro experimental — isso significa que um ajuste de mínimos quadrados ordinários (que assume erro só em y) introduz viés; discutirei isso depois.

Passo 3

Preparação dos dados no mesmo sistema de unidades para fazer \dfrac{V_{o}}{[S]} de forma direta. Como V_{o} está em \mu\mathrm{M}/\mathrm{min}, é conveniente expressar [S] em \mu\mathrm{M} (multiplicar [S] em \mathrm{M} por 10^{6}). Convertendo os valores de [S]:
\begin{array}{c} 2{,}5\times10^{-6}\\ \mathrm{M}=2{,}5\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 4\times10^{-6}\\ \mathrm{M}=4\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 1\times10^{-5}\\ \mathrm{M}=10\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 2\times10^{-5}\\ \mathrm{M}=20\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 4\times10^{-5}\\ \mathrm{M}=40\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 1\times10^{-4}\\ \mathrm{M}=100\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 2\times10^{-3}\\ \mathrm{M}=2000\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 1\times10^{-2}\\ \mathrm{M}=10000\\ \mu\mathrm{M},\\\\ 2\times10^{-1}\\ \mathrm{M}=200000\\ \mu\mathrm{M}. \end{array}
Agora calculo \dfrac{V_{o}}{[S]} para cada linha (unidade resultante é \mathrm{min}^{-1}):
\begin{array}{cc} [S]\\ (\mu\mathrm{M}) & \dfrac{V_{o}}{[S]}\\ (\mathrm{min}^{-1})\\hline 2{,}5 & \dfrac{28}{2{,}5}=11{,}2\\\\ 4 & \dfrac{40}{4}=10{,}0\\\\ 10 & \dfrac{70}{10}=7{,}0\\\\ 20 & \dfrac{95}{20}=4{,}75\\\\ 40 & \dfrac{112}{40}=2{,}8\\\\ 100 & \dfrac{128}{100}=1{,}28\\\\ 2000 & \dfrac{139}{2000}=0{,}0695\\\\ 10000 & \dfrac{140}{10000}=0{,}014\\\\ 200000 & \dfrac{140}{200000}=0{,}0007 \end{array}
Esses valores de x=\dfrac{V_{o}}{[S]} serão usados no ajuste linear com y=V_{o}.

Passo 4

Agora faço o ajuste linear por mínimos quadrados ordinários para a reta
V_{o} = V_{m} + m\left(\frac{V_{o}}{[S]}\right),
sendo m=-K_{m}. As fórmulas usuais (regressão linear) são:
m=\frac{n\sum x_{i}y_{i}-\left(\sum x_{i}\right)\left(\sum y_{i}\right)} {n\sum x_{i}^{2}-\left(\sum x_{i}\right)^{2}}, \qquad b=\frac{\sum y_{i}-m\sum x_{i}}{n},
com b=V_{m}, x_{i}=V_{o}/[S] e y_{i}=V_{o}. Vou calcular as somas necessárias (usei os valores do Passo 3):
Cálculos das somas:
\begin{aligned} n&=9,\\\ \sum x_{i}&\approx 37{,}1142,\\\ \sum y_{i}&=892,\\\ \sum x_{i}^{2}&\approx 306{,}48593,\\\ \sum x_{i}y_{i}&\approx 2144{,}0085. \end{aligned}
(Detalhe rápido: peguei \sum x_{i} somando 11{,}2+10+7+4{,}75+2{,}8+1{,}28+0{,}0695+0{,}014+0{,}0007\approx37{,}1142, e calculei \sum x^2 e \sum x y correspondendo aos produtos e quadrados mostrados.)

Passo 5

Calculo do declive m e do intercepto b com os números acima:
\begin{aligned} \text{numerador }&=n\sum x_{i}y_{i}-\left(\sum x_{i}\right)\left(\sum y_{i}\right) =9\cdot2144{,}0085-37{,}1142\cdot892\approx -13809{,}7899,\\[4pt] \text{denominador }&=n\sum x_{i}^{2}-\left(\sum x_{i}\right)^{2} =9\cdot306{,}48593-(37{,}1142)^{2}\approx 1380{,}9095. \end{aligned}
Logo
m=\frac{-13809{,}7899}{1380{,}9095}\approx -10{,}00.
O intercepto é
b=\frac{\sum y_{i}-m\sum x_{i}}{n} =\frac{892-(-10{,}00)\cdot37{,}1142}{9}\approx140{,}35.]

Passo 6

Interpretação dos parâmetros extraídos:
m\approx -10{,}00\quad\Rightarrow\quad K_{m}=-m\approx 10{,}00\\ \mu\mathrm{M}.
b\approx 140{,}35\quad\Rightarrow\quad V_{m}\approx 140{,}35\\ \mu\mathrm{M}/\mathrm{min}.
Convertendo K_{m} para molar:
K_{m}\approx 10{,}0\\ \mu\mathrm{M}=1{,}0\times10^{-5}\\ \mathrm{M}.
Observação de verificação simples (didática): a velocidade observada V_{o}=70\\ \mu\mathrm{M}/\mathrm{min} ocorre para [S]=1\times10^{-5}\\ \mathrm{M}=10\\ \mu\mathrm{M} (dados da tabela). Como 70 é aproximadamente metade de 140, isso concorda com K_{m}\approx10\\ \mu\mathrm{M} (por definição V_{o}=V_{m}/2 quando [S]=K_{m}). Então os resultados fazem sentido com a observação direta dos dados.

Passo 7

Comentário sobre possíveis diferenças entre métodos (didático e prático):
  • Lineweaver–Burk (recíprocos) transforma \dfrac{1}{V_{o}}=\dfrac{K_{m}}{V_{m}}\cdot\dfrac{1}{[S]}+\dfrac{1}{V_{m}}. Esse método dá peso exagerado aos pontos com baixas concentrações (pequenos [S]), amplificando erros experimentais nesses pontos — portanto tende a ser pouco robusto.
  • Eadie–Hofstee (o usado aqui) distribui os erros de forma diferente, mas tem a limitação de que a variável x ( V_{o}/[S]) depende de V_{o}, ou seja, o mesmo erro em V_{o} aparece tanto em x quanto em y. Usar mínimos quadrados ordinários (erro apenas em y) pode introduzir viés.
  • Hanes–Woolf ( [S]/V_{o} vs [S]) costuma ser numericamente melhor que Lineweaver–Burk porque não usa recíprocos de V_{o} e distribui melhor os pesos; ainda assim é linearização.
  • Melhor abordagem (quando possível) é ajuste não-linear direto da equação de Michaelis–Menten por mínimos quadrados (ajuste de V_{m} e K_{m} minimizando o erro em V_{o} sem linearizar): esse método trata corretamente os erros e dá estimativas mais confiáveis e intervalos de confiança.
    Resumo prático: os métodos lineares (Lineweaver–Burk, Eadie–Hofstee, Hanes–Woolf) tendem a dar estimativas próximas quando os dados são bons e há saturação clara; entretanto, Lineweaver–Burk é o mais enviesado, Eadie–Hofstee tem o problema de erro em ambas as variáveis, e o ajuste não-linear é preferível se disponível.

Resposta

V_{m}\approx 140{,}35\\ \mu\mathrm{M}/\mathrm{min}
K_{m}\approx 10{,}0\\ \mu\mathrm{M}\\ ( =1{,}0\times10^{-5}\\ \mathrm{M})

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