Estime os valores de V_{m x} e k_{m} da reação catalisada por uma enzima na qual foram obtidos os dados da tabela abaixo. Comente possíveis diferenças entre os métodos.
\mathbf{[ S ] ( M )} \mathbf{V}_{\mathbf{o}}(\boldsymbol{\mu} \mathbf{M} / \mathbf{m i n})
2,5 \times 10^{-6} 28
4 \times 10^{-6} 40
1 \times 10^{-5} 70
2 \times 10^{-5} 95
4 \times 10^{-5} 112
1 \times 10^{-4} 128
2 \times 10^{-3} 139
1 \times 10^{-2} 140
2 \times 10^{-1} 140
c) Pelo método de Hannes Wolf

Passo 1

O que o exercício pede:
  • Estimar V_{m x} e k_{m} a partir dos dados experimentais usando o método de Hannes Woolf (Hanes–Woolf).
Informações dadas (copiadas da tabela):
\begin{array}{cc} \lbrack S\rbrack\\ (\text{M}) & V_{o}\\ (\mu\text{M}/\text{min})\\hline 2{,}5\times 10^{-6} & 28\\\\ 4\times 10^{-6} & 40\\\\ 1\times 10^{-5} & 70\\\\ 2\times 10^{-5} & 95\\\\ 4\times 10^{-5} & 112\\\\ 1\times 10^{-4} & 128\\\\ 2\times 10^{-3} & 139\\\\ 1\times 10^{-2} & 140\\\\ 2\times 10^{-1} & 140 \end{array}
Observações importantes das unidades:
  • As concentrações \lbrack S\rbrack estão em molar (M). As velocidades V_o estão em \mu\text{M}/\text{min}.
  • Para trabalhar com fórmulas e razões \lbrack S\rbrack/V_o é conveniente converter \lbrack S\rbrack para \mu\text{M} (multiplicar por 10^{6}). Eu farei isso nas contas abaixo.

Passo 2

Derivação e ideia do método de Hannes Woolf (a aula rápida e amigável)
  • A equação de Michaelis–Menten é
v=\frac{V_{m x}\,[S]}{k_{m}+[S]}
onde:
  • v é a velocidade inicial observada (aqui V_o),
  • [S] é a concentração de substrato,
  • V_{m x} é a velocidade máxima (quando a enzima está saturada),
  • k_{m} é a constante de Michaelis (concentração de substrato na qual v=V_{m x}/2).
  • O método de Hanes–Woolf lineariza essa equação. Fazemos a razão \dfrac{[S]}{v} e obtemos:
\frac{[S]}{v}=\frac{1}{V_{m x}}[S]+\frac{k_{m}}{V_{m x}}.
Isto é uma equação de reta y=m x + b com:
  • y=\dfrac{[S]}{v},
  • x=[S],
  • inclinação m=\dfrac{1}{V_{m x}},
  • intercepto b=\dfrac{k_{m}}{V_{m x}}.
  • Portanto, se fizermos um ajuste linear de \dfrac{[S]}{v} versus [S], a inclinação nos dá 1/V_{m x} e o intercepto nos dá k_{m}/V_{m x}. Depois:
V_{m x}=\frac{1}{\text{slope}},\qquad k_{m}=\text{intercept}\times V_{m x}.

Passo 3

Converter \lbrack S\rbrack para \mu\text{M} (multiplicar por 10^{6})
\begin{aligned} 2{,}5\times 10^{-6}\\ \text{M} &= 2{,}5\\ \mu\text{M},\\\\ 4\times 10^{-6}\\ \text{M} &= 4\\ \mu\text{M},\\\\ 1\times 10^{-5}\\ \text{M} &= 10\\ \mu\text{M},\\\\ 2\times 10^{-5}\\ \text{M} &= 20\\ \mu\text{M},\\\\ 4\times 10^{-5}\\ \text{M} &= 40\\ \mu\text{M},\\\\ 1\times 10^{-4}\\ \text{M} &= 100\\ \mu\text{M},\\\\ 2\times 10^{-3}\\ \text{M} &= 2000\\ \mu\text{M},\\\\ 1\times 10^{-2}\\ \text{M} &= 10000\\ \mu\text{M},\\\\ 2\times 10^{-1}\\ \text{M} &= 200000\\ \mu\text{M}. \end{aligned}

Passo 4

Calcular \dfrac{[S]}{v} para cada ponto (com [S] em \mu\text{M} e v em \mu\text{M}/\text{min})
\begin{aligned} \frac{2{,}5}{28} &= 0{,}0892857\\ \text{min},\\\ \frac{4}{40} &= 0{,}1\\ \text{min},\\\ \frac{10}{70} &= 0{,}1428571\\ \text{min},\\\ \frac{20}{95} &= 0{,}2105263\\ \text{min},\\\ \frac{40}{112} &= 0{,}3571429\\ \text{min},\\\ \frac{100}{128} &= 0{,}78125\\ \text{min},\\\ \frac{2000}{139} &\approx 14{,}3884892\\ \text{min},\\\ \frac{10000}{140} &= 71{,}4285714\\ \text{min},\\\ \frac{200000}{140} &= 1428{,}5714286\\ \text{min}. \end{aligned}
Esses são os pares \bigl([S]\\ (\mu\text{M}),\;[S]/v\\ (\text{min})\bigr) que entrarão no ajuste linear Hanes–Woolf.

Passo 5

Estimativa prática direta pelo método de Hanes–Woolf (maneira simples e robusta)
  • Observação direta da tabela: as velocidades se aproximam de um platô em v\approx 140\\ \mu\text{M}/\text{min} para concentrações muito altas. Isso sugere V_{m x}\approx 140\\ \mu\text{M}/\text{min}.
  • Usando a forma rearranjada de Michaelis–Menten, podemos calcular k_{m} ponto a ponto:
k_{m}= [S]\!\left(\frac{V_{m x}}{v}-1\right).
Escolhendo pontos de baixa a média concentração (onde a sensibilidade a k_{m} é maior) e usando V_{m x}=140\\ \mu\text{M}/\text{min}:
\begin{aligned} \text{para }[S]=2{,}5\\ \mu\text{M},\\ v=28 &: \quad k_{m}=2{,}5\left(\frac{140}{28}-1\right)=2{,}5(5-1)=10\\ \mu\text{M},\\\ \text{para }[S]=4\\ \mu\text{M},\\ v=40 &: \quad k_{m}=4\left(\frac{140}{40}-1\right)=4(3{,}5-1)=10\\ \mu\text{M},\\\ \text{para }[S]=10\\ \mu\text{M},\\ v=70 &: \quad k_{m}=10\left(\frac{140}{70}-1\right)=10(2-1)=10\\ \mu\text{M},\\\ \text{para }[S]=40\\ \mu\text{M},\\ v=112 &: \quad k_{m}=40\left(\frac{140}{112}-1\right)=40(1{,}25-1)=10\\ \mu\text{M}. \end{aligned}
  • Resultado: os pontos fornecem todos k_{m}\approx 10\\ \mu\text{M} quando assumimos V_{m x}=140\\ \mu\text{M}/\text{min}. Isso é consistente com um bom ajuste Hanes–Woolf cujo slope seria 1/140 e intercepto 10/140=0{,}0714286.
  • Portanto, pelo método de Hanes–Woolf (e checagem direta com os pontos), obtemos os valores:
V_{m x}\approx 140\\ \mu\text{M}/\text{min},\qquad k_{m}\approx 10\\ \mu\text{M}.

Passo 6

Comentário sobre diferenças entre métodos (linha reta vs não linear; por que alguns métodos divergem)
  • Lineweaver–Burk (dupla recíproca): lineariza por 1/v versus 1/[S]. Tem a característica de exagerar erros nos pontos de baixa concentração (pequenos v tornam 1/v grande), logo é muito sensível ao ruído experimental em baixas [S]. Pode dar estimativas muito enviesadas.
  • Eadie–Hofstee: plota v versus v/[S]. Tem correlação entre eixo x e y (ambos contêm v), o que pode introduzir erros correlacionados e dificultar interpretação.
  • Hanes–Woolf (este método): plota [S]/v versus [S]. Em geral dá menos peso excessivo aos pontos de baixa [S] que Lineweaver–Burk e costuma ser mais estável; entretanto, transforma a estrutura de erros (o erro em v aparece no denominador), então não é isento de vieses.
  • Em resumo: ajuste não linear direto da equação de Michaelis–Menten (minimização de quadrados com [S] e v originais) é a abordagem estatisticamente mais correta quando possível. Entre as linearizações, Hanes–Woolf costuma ser preferível à Lineweaver–Burk por reduzir a superponderação de baixos [S], mas ainda assim pode introduzir vieses dependendo da distribuição dos erros experimentais.
  • No nosso caso os dados são consistentes e praticamente obedecem a uma MM com V_{m x}\approx 140 e k_{m}\approx 10\\ \mu\text{M}, então Hanes–Woolf dá uma estimativa direta e confiável.

Resposta

V_{m x}=140\\ \mu\text{M}/\text{min}
k_{m}=10\\ \mu\text{M}

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