QUESTÃO 3. As proteínas IDPs (intrinsically disordered protein) formam uma classe única de proteínas que não requer uma estabilidade estrutural para exercer sua função. Esta estrutura desordenada é particularmente importante em proteínas envolvidas na sinalização celular, transcrição e função de remodelamento da cromatina. As IDPs cobrem um espectro estrutural de estados de totalmente não estruturados a parcialmente estruturados e incluem random coils, (pré-) molten globules e grandes proteínas de múltiplos domínios conectadas por linkers flexíveis.
A. Sobre o enovelamento de IDPs, quais as técnicas que poderemos utilizar para estudar a desnaturação e renaturação durante ensaio com variação de temperatura?
B. Comente, se houver, quais os outros parâmetros que poderemos obter com estas determinações.
A. Sobre o enovelamento de IDPs, quais as técnicas que poderemos utilizar para estudar a desnaturação e renaturação durante ensaio com variação de temperatura?
B. Comente, se houver, quais os outros parâmetros que poderemos obter com estas determinações.
Passo 1
O enunciado trata das proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs) e pergunta, na parte A, quais técnicas podemos usar para acompanhar a desnaturação e renaturação durante variação de temperatura; na parte B, quais parâmetros termodinâmicos ou estruturais podemos extrair desses ensaios.
Passo 2
As técnicas mais empregadas para estudar em função da temperatura o enovelamento/reenovelamento de proteínas, inclusive IDPs, são:
- espectroscopia de dicroísmo circular (CD), que monitora mudanças na estrutura secundária a partir do sinal de rotatividade óptica;
- calorimetria diferencial de varredura (DSC), que mede diretamente a capacidade calorífica e identifica transições térmicas;
- espectroscopia de fluorescência intrínseca (triptófano/tirosina) ou com sondas extrínsecas (por ex. ANS), para acompanhar alterações no ambiente hidrofóbico;
- medidas de absorção no ultravioleta-visível (UV–Vis), para detectar perturbações no espectro de aminoácidos aromáticos;
- espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), sensível a bandas amida I e II e ao conteúdo secundário;
- em casos mais avançados, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ou NMR de relaxação, para detalhes cinéticos e estruturais.
Passo 3
A partir das curvas de sinal (CD, fluorescência, UV–Vis) ou do pico de calor em DSC, podemos extrair:
– , temperatura de transição onde metade da proteína está desnaturada;
– entalpia de transição , área sob o pico de calorimetria;
– variação de capacidade calorífica (DSC);
– entropia de transição , a partir de
;
– energia livre de estabilização a qualquer temperatura, via ajuste de curva de desnaturação;
– parâmetros de cooperatividade (m-valor) na análise de dois estados;
– em ensaios de renaturação: cinéticas de dobra/desdobra e eventual histerese térmica;
– informações sobre populações de estados intermediários (molten globule, coil) quando combinamos técnicas.
–
– entalpia de transição
– variação de capacidade calorífica
– entropia de transição
– energia livre de estabilização
– parâmetros de cooperatividade (m-valor) na análise de dois estados;
– em ensaios de renaturação: cinéticas de dobra/desdobra e eventual histerese térmica;
– informações sobre populações de estados intermediários (molten globule, coil) quando combinamos técnicas.
Resposta
A. As técnicas principais são espectroscopia de dicroísmo circular (CD), calorimetria diferencial de varredura (DSC), espectroscopia de fluorescência intrínseca e extrínseca, absorção UV–Vis e FTIR. Em nível mais profundo também usamos NMR de relaxação ou ITC.
B. Com esses ensaios podemos obter a temperatura de transição , a entalpia de transição
, a entropia
, a capacidade calorífica
, a energia livre
, índices de cooperatividade (m-valor), as cinéticas de dobra/desdobra e a detecção de estados intermediários.
B. Com esses ensaios podemos obter a temperatura de transição