Suponha que você possui 10 amostras para executar uma reação de PCR com os seguintes primers:
CAS1: 5 GGAATTGACGGAAGGGCACC 3
CAS2: 5 ACGGGCGGTGTGTACAAAGG 3
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Calcule a temperatura de anelamento (demonstre os cálculos).
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Calcule a temperatura de anelamento (demonstre os cálculos).
Passo 1
Beleza, o exercício pede pra gente calcular a temperatura de anelamento (Ta) de dois primers usados numa PCR que geram um produto de 492 pb. Isso é Biologia Molecular, mais precisamente PCR, e a gente vai usar a regra de Wallace (fórmula empírica) pra estimar o “melting temperature” ™ de cada primer. Depois a gente define a Ta como uns 3–5 °C abaixo desse Tm.
Passo 2
Primeiro, o que é Tm? É a temperatura em que metade das moléculas de DNA primer-template estão emparelhadas (hibridizadas) e metade estão separadas.
A regra de Wallace diz:
A regra de Wallace diz:
onde #A, #T, #G e #C são as contagens de cada nucleotídeo no primer.
Passo 3
Vamos contar as bases do primer CAS1 (20 pb):
5′ G G A A T T G A C G G A A G G G C A C C 3′
5′ G G A A T T G A C G G A A G G G C A C C 3′
- #G = 8
- #C = 4
- #A = 6
- #T = 2
Logo:
Passo 4
Agora o primer CAS2 (20 pb):
5′ A C G G G C G G T G T G T A C A A A G G 3′
5′ A C G G G C G G T G T G T A C A A A G G 3′
- #G = 9
- #C = 3
- #A = 5
- #T = 3
Então:
Passo 5
Como os dois primers têm Tm iguais (64 °C), a gente costuma definir a temperatura de anelamento de PCR cerca de 3–5 °C abaixo do Tm:
Resposta
Temperatura de anelamento ≃ 59 °C.