Suponha que você possui 10 amostras para executar uma reação de PCR com os seguintes primers:

CAS1: 5 GGAATTGACGGAAGGGCACC 3

CAS2: 5 ACGGGCGGTGTGTACAAAGG 3
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Calcule a temperatura de anelamento (demonstre os cálculos).

Passo 1

Beleza, o exercício pede pra gente calcular a temperatura de anelamento (Ta) de dois primers usados numa PCR que geram um produto de 492 pb. Isso é Biologia Molecular, mais precisamente PCR, e a gente vai usar a regra de Wallace (fórmula empírica) pra estimar o “melting temperature” ™ de cada primer. Depois a gente define a Ta como uns 3–5 °C abaixo desse Tm.

Passo 2

Primeiro, o que é Tm? É a temperatura em que metade das moléculas de DNA primer-template estão emparelhadas (hibridizadas) e metade estão separadas.
A regra de Wallace diz:
Tm ;=; 2cdot(#A + #T);+;4cdot(#G + #C)
onde #A, #T, #G e #C são as contagens de cada nucleotídeo no primer.

Passo 3

Vamos contar as bases do primer CAS1 (20 pb):
5′ G G A A T T G A C G G A A G G G C A C C 3′
  • #G = 8
  • #C = 4
  • #A = 6
  • #T = 2
    Logo:
Tm1 = 2cdot(6+2) + 4cdot(8+4) = 2cdot8 + 4cdot12 = 16 + 48 = 64;^circ C

Passo 4

Agora o primer CAS2 (20 pb):
5′ A C G G G C G G T G T G T A C A A A G G 3′
  • #G = 9
  • #C = 3
  • #A = 5
  • #T = 3
    Então:
Tm2 = 2cdot(5+3) + 4cdot(9+3) = 2cdot8 + 4cdot12 = 16 + 48 = 64;^circ C

Passo 5

Como os dois primers têm Tm iguais (64 °C), a gente costuma definir a temperatura de anelamento de PCR cerca de 3–5 °C abaixo do Tm:
Tanelamento = Tm - 5;^circ C = 64 - 5 = 59;^circ C

Resposta

Temperatura de anelamento ≃ 59 °C.

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