Suponha que você possui 10 amostras para executar uma reação de PCR com os seguintes primers:
CAS1: 5 GGAATTGACGGAAGGGCACC 3
CAS2: 5 ACGGGCGGTGTGTACAAAGG 3
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Qual será a programação que deve ser colocada no termociclador para esta reação? Complete a tabela abaixo com as temperaturas e tempos exatos, ou seja, não colocar faixas de temperatura e tempo. Estabeleça números exatos! A temperatura de anelamento será a calculada no item a e atente-se para o tamanho do produto esperado para definir o tempo de extensão da Taq polimerase. Não esqueça de estabelecer o número de ciclos.
Tabela: Programação da reação de PCR no termociclador.
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Qual será a programação que deve ser colocada no termociclador para esta reação? Complete a tabela abaixo com as temperaturas e tempos exatos, ou seja, não colocar faixas de temperatura e tempo. Estabeleça números exatos! A temperatura de anelamento será a calculada no item a e atente-se para o tamanho do produto esperado para definir o tempo de extensão da Taq polimerase. Não esqueça de estabelecer o número de ciclos.
Tabela: Programação da reação de PCR no termociclador.
Número de ciclos: | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Desnaturação <br> inicial | Desnaturação | Anelamento | Extensão | Final da <br> Extensão | Resfriamento | |
Temperatura | ||||||
Tempo |
Passo 1
Beleza, a gente tem uma reação de PCR com 10 amostras, usando dois primers (CAS1 e CAS2) que geram um fragmento de 492 pb. O que precisamos fazer é montar o programa do termociclador: temperatura e tempo para cada etapa (desnaturação inicial, desnaturação, anelamento, extensão, extensão final e resfriamento) e definir o número de ciclos. Para isso, vamos calcular a temperatura de anelamento (Tₘ) dos primers e determinar o tempo de extensão baseado no tamanho do produto.
Passo 2
Primeiro, vamos calcular a temperatura de melting (Tₘ) de cada primer usando a regra de Wallace:
Isso vale para primers de até ~25 nt.
Para o primer CAS1 (20 nt):
Sequência: GGAATTGACGGAAGGGCACC
Contagens: A=6, T=2, G=8, C=4
Sequência: GGAATTGACGGAAGGGCACC
Contagens: A=6, T=2, G=8, C=4
Para o primer CAS2 (20 nt):
Sequência: ACGGGCGGTGTGTACAAAGG
Contagens: A=5, T=3, G=9, C=3
Sequência: ACGGGCGGTGTGTACAAAGG
Contagens: A=5, T=3, G=9, C=3
Passo 3
Como os dois primers têm Tₘ ≈ 64 °C, a temperatura de anelamento costuma ficar cerca de 3–5 °C abaixo do menor Tₘ. Vamos escolher:
Passo 4
Agora, o tempo de extensão. A Taq polimerase estende algo em torno de 1 kb por minuto (às vezes um pouco mais). Como o nosso fragmento tem 492 pb, 30 s a 72 °C é mais do que suficiente para completar a extensão.
Passo 5
Faltam definir as temperaturas e tempos padrão:
- Desnaturação inicial: aquece tudo e garante que a fita abra. Usamos 95 °C por 3 min.
- Desnaturação cíclica: 95 °C por 30 s em cada ciclo.
- Anelamento: 59 °C por 30 s.
- Extensão: 72 °C por 30 s.
- Extensão final: 72 °C por 5 min (para garantir que tudo termine direitinho).
- Resfriamento: 4 °C indefinidamente (ou até você tirar o tubo).
E escolhemos 30 ciclos, padrão para amplificar bem sem exagerar.
Resposta
Desnaturação inicial | Desnaturação (ciclo) | Anelamento | Extensão (ciclo) | Extensão final | Resfriamento | |
---|---|---|---|---|---|---|
Temperatura (°C) | 95 | 95 | 59 | 72 | 72 | 4 |
Tempo | 3 min | 30 s | 30 s | 30 s | 5 min | indefinido |
Número de ciclos | 30 | } |