Suponha que você possui 10 amostras para executar uma reação de PCR com os seguintes primers:

CAS1: 5 GGAATTGACGGAAGGGCACC 3

CAS2: 5 ACGGGCGGTGTGTACAAAGG 3
Os primers dados geram um produto esperado de 492 pares de bases.
Qual será a programação que deve ser colocada no termociclador para esta reação? Complete a tabela abaixo com as temperaturas e tempos exatos, ou seja, não colocar faixas de temperatura e tempo. Estabeleça números exatos! A temperatura de anelamento será a calculada no item a e atente-se para o tamanho do produto esperado para definir o tempo de extensão da Taq polimerase. Não esqueça de estabelecer o número de ciclos.
Tabela: Programação da reação de PCR no termociclador.
Número de ciclos:
Desnaturação <br> inicial Desnaturação Anelamento Extensão Final da <br> Extensão Resfriamento
Temperatura
Tempo

Passo 1

Beleza, a gente tem uma reação de PCR com 10 amostras, usando dois primers (CAS1 e CAS2) que geram um fragmento de 492 pb. O que precisamos fazer é montar o programa do termociclador: temperatura e tempo para cada etapa (desnaturação inicial, desnaturação, anelamento, extensão, extensão final e resfriamento) e definir o número de ciclos. Para isso, vamos calcular a temperatura de anelamento (Tₘ) dos primers e determinar o tempo de extensão baseado no tamanho do produto.

Passo 2

Primeiro, vamos calcular a temperatura de melting (Tₘ) de cada primer usando a regra de Wallace:
Tm = 2^circC times (#A + #T) ;+; 4^circC times (#G + #C)
Isso vale para primers de até ~25 nt.
Para o primer CAS1 (20 nt):
Sequência: GGAATTGACGGAAGGGCACC
Contagens: A=6, T=2, G=8, C=4
Tm1 = 2times(6+2) + 4times(8+4) = 2times8 + 4times12 = 16 + 48 = 64^circC
Para o primer CAS2 (20 nt):
Sequência: ACGGGCGGTGTGTACAAAGG
Contagens: A=5, T=3, G=9, C=3
Tm2 = 2times(5+3) + 4times(9+3) = 2times8 + 4times12 = 16 + 48 = 64^circC

Passo 3

Como os dois primers têm Tₘ ≈ 64 °C, a temperatura de anelamento costuma ficar cerca de 3–5 °C abaixo do menor Tₘ. Vamos escolher:
Tanelamento = 64^circC - 5^circC = 59^circC

Passo 4

Agora, o tempo de extensão. A Taq polimerase estende algo em torno de 1 kb por minuto (às vezes um pouco mais). Como o nosso fragmento tem 492 pb, 30 s a 72 °C é mais do que suficiente para completar a extensão.

Passo 5

Faltam definir as temperaturas e tempos padrão:
  • Desnaturação inicial: aquece tudo e garante que a fita abra. Usamos 95 °C por 3 min.
  • Desnaturação cíclica: 95 °C por 30 s em cada ciclo.
  • Anelamento: 59 °C por 30 s.
  • Extensão: 72 °C por 30 s.
  • Extensão final: 72 °C por 5 min (para garantir que tudo termine direitinho).
  • Resfriamento: 4 °C indefinidamente (ou até você tirar o tubo).
    E escolhemos 30 ciclos, padrão para amplificar bem sem exagerar.

Resposta

Desnaturação inicial Desnaturação (ciclo) Anelamento Extensão (ciclo) Extensão final Resfriamento
Temperatura (°C) 95 95 59 72 72 4
Tempo 3 min 30 s 30 s 30 s 5 min indefinido
Número de ciclos 30 }

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