A descarboxilação do glioxalato (S) pela mitocôndria é inibida pelo malonato (I). Os dados abaixo foram obtidos para experimentos em batelada. Que tipo de inibição é essa? Determine as constantes \mathrm{v}_{\text {máx }}, \mathrm{K}_{\mathrm{M}}á e \mathrm{K}_{\mathrm{I}}.
Gliox, S (mM) Produtividade de \mathrm{CO}_{2}, v (mmoles/L.h)
\mathrm{I}=0 \mathrm{I}=1,26 \mathrm{mM} \mathrm{I}=1,95 \mathrm{mM}
0,25 1,02 0,73 0,56
0,33 1,39 0,87 0,75
0,40 1,67 1,09 0,85
0,50 1,89 1,30 1,00
0,60 2,08 1,41 1,28
0,75 2,44 1,82 1,39
1,00 2,50 2,17 1,82

Passo 1

Vou identificar claramente o que o enunciado pede e quais dados temos.
  • O enunciado pede:
    • Determinar que tipo de inibição o inibidor malonato ( I) causa sobre a descarboxilação do glioxalato ( S).
    • Calcular as constantes v_{\text{máx}}, K_{M}á e K_{I}.
  • Dados fornecidos (peguei estes valores da tabela do enunciado):
    • Concentrações de substrato S (em mM): 0{,}25,\;0{,}33,\;0{,}40,\;0{,}50,\;0{,}60,\;0{,}75,\;1{,}00.
    • Velocidades v (produtividade de \mathrm{CO}_2, em mmoles/L.h) para três condições de inibidor:
      • \;I=0: v=1{,}02,\;1{,}39,\;1{,}67,\;1{,}89,\;2{,}08,\;2{,}44,\;2{,}50.
      • \;I=1{,}26\\ \text{mM}: v=0{,}73,\;0{,}87,\;1{,}09,\;1{,}30,\;1{,}41,\;1{,}82,\;2{,}17.
      • \;I=1{,}95\\ \text{mM}: v=0{,}56,\;0{,}75,\;0{,}85,\;1{,}00,\;1{,}28,\;1{,}39,\;1{,}82.
A partir daqui vou aplicar uma análise cinética para identificar o tipo de inibição e estimar as constantes pedidas.

Passo 2

Conceitos e método que vou usar (aula rápida antes de calcular).
  • Equação de Michaelis–Menten (para reação simples, sem inibidor):
    v = \frac{v_{\text{máx}}[S]}{K_M + [S]},á
    em que:
    • v é a velocidade observada,
    • [S] é a concentração de substrato,
    • v_{\text{máx}}á é a velocidade máxima (quando a enzima está saturada),
    • K_M é a constante de Michaelis (concentração de substrato à qual v = v_{\text{máx}}/2á).
  • Linearização de Lineweaver–Burk (útil para ajustar reta por regressão linear):
    \frac{1}{v} = \frac{K_M}{v_{\text{máx}}}\cdot\frac{1}{[S]} + \frac{1}{v_{\text{máx}}}.áá
    Aqui a equação é da forma \frac{1}{v}=a\cdot\frac{1}{[S]}+b, com
    a=\frac{K_M}{v_{\text{máx}}},\qquad b=\frac{1}{v_{\text{máx}}}.áá
    Ajustando uma reta a \big(1/[S],\,1/v\big) obtemos a e b, daí v_{\text{máx}}=1/bá e K_M=a\cdot v_{\text{máx}}á.
  • Efeitos típicos de inibidores:
    • Inibição competitiva: v_{\text{máx}}á inalterado; K_{M,\text{app}} = K_M\big(1 + \dfrac{[I]}{K_I}\big) (ou seja, K_M aparente aumenta com [I]).
    • Inibição não-competitiva (pura): K_M inalterado; v_{\text{máx}}á diminui.
    • Inibição mista/anti-competitiva: ambos mudam de forma característica diferente.
  • Plano: para cada valor de [I] vou calcular os pares \big(1/[S],\,1/v\big), ajustar uma reta por regressão linear (fórmulas fechadas para coeficientes da reta), extrair v_{\text{máx}}á e K_{M,\text{app}}. Em seguida vou verificar como v_{\text{máx}}á e K_{M,\text{app}} variam com [I]. Se v_{\text{máx}}á permanecer praticamente constante e K_{M,\text{app}} aumentar com [I], isso indica inibição competitiva; então calculo K_I pela relação
    K_{M,\text{app}} = K_M\Big(1 + \frac{[I]}{K_I}\Big).

Passo 3

Preparação dos dados invertidos \big(1/[S],\,1/v\big).
  • Valores de \dfrac{1}{[S]} (em \text{mM}^{-1}), obtidos a partir das concentrações de S:
    \frac{1}{[S]} = 4{,}000,\;3{,}0303,\;2{,}5,\;2{,}0,\;1{,}666667,\;1{,}333333,\;1{,}0.
  • Valores de \dfrac{1}{v} (em \text{L.h/mmol}) para cada I (calculei os recíprocos dos v da tabela):
    • Para \;I=0:
      \frac{1}{v}=0{,}980392,\;0{,}719424,\;0{,}598802,\;0{,}529100,\;0{,}480769,\;0{,}409836,\;0{,}4.
    • Para \;I=1{,}26\\ \text{mM}:
      \frac{1}{v}=1{,}369863,\;1{,}149425,\;0{,}917431,\;0{,}769231,\;0{,}709220,\;0{,}549451,\;0{,}460829.
    • Para \;I=1{,}95\\ \text{mM}:
      \frac{1}{v}=1{,}785714,\;1{,}333333,\;1{,}176471,\;1{,}0,\;0{,}78125,\;0{,}719424,\;0{,}549451.
(Se quiser, esses recíprocos podem ser verificados rapidamente com uma calculadora. Eu os calculei a partir dos v originais.)

Passo 4

Ajuste linear por mínimos quadrados (fórmulas) para cada [I].
Para uma série de pontos (x_i,y_i) com n pontos, os coeficientes da reta y = a x + b são:
a = \frac{n\sum x_i y_i - \big(\sum x_i\big)\big(\sum y_i\big)}{n\sum x_i^2 - \big(\sum x_i\big)^2}, \qquad b = \frac{\sum y_i - a\sum x_i}{n}.
Aqui x_i = 1/[S]_i e y_i = 1/v_i, e n=7.
Vou aplicar essas fórmulas separadamente para cada condição de [I]. Para evitar confusão com muitos números, mostro os somatórios principais já calculados para cada caso.
(Obs.: os somatórios \sum x_i e \sum x_i^2 são os mesmos para os três conjuntos porque x_i só depende de [S].)
  • Constantes comuns (calculadas a partir de x_i=1/[S]): n = 7, \qquad \sum x_i \approx 15{,}530303, \qquad \sum x_i^2 \approx 40{,}988076.
Agora os somatórios \sum y_i e \sum x_i y_i para cada I (valores calculados):
  • Para \;I=0:
    \sum y_i \approx 4{,}118323,\qquad \sum x_i y_i \approx 10{,}404580.
  • Para \;I=1{,}26\\ \text{mM}:
    \sum y_i \approx 5{,}925450,\qquad \sum x_i y_i \approx 15{,}170062.
  • Para \;I=1{,}95\\ \text{mM}:
    \sum y_i \approx 7{,}345643,\qquad \sum x_i y_i \approx 18{,}935204.

Passo 5

Cálculo dos coeficientes a e b e extração de v_{\text{máx}}á e K_{M,\text{app}} para \;I=0.
  • Substituindo nos fórmulas: a = \frac{7\cdot10{,}404580 - 15{,}530303\cdot4{,}118323}{7\cdot40{,}988076 - (15{,}530303)^2} \approx 0{,}1941,
b = \frac{4{,}118323 - 0{,}1941\cdot15{,}530303}{7} \approx 0{,}1577.
  • Então: \frac{1}{v_{\text{máx}}} = b \approx 0{,}1577 \quad\Rightarrow\quad v_{\text{máx}} \approx \frac{1}{0{,}1577} \approx 6{,}34\\ \text{mmoles/L.h},áá
K_M = a\cdot v_{\text{máx}} \approx 0{,}1941\cdot6{,}34 \approx 1{,}23\\ \text{mM}.á
Portanto, a partir dos dados sem inibidor estimei v_{\text{máx}}\approx6{,}34á e K_M\approx1{,}23.

Passo 6

Mesmo procedimento para \;I=1{,}26\\ \text{mM} (valores calculados acima).
  • Cálculo dos coeficientes:
    a \approx 0{,}3098,\qquad b \approx 0{,}1592.
  • Então:
    v_{\text{máx,app}} = \frac{1}{b} \approx \frac{1}{0{,}1592} \approx 6{,}28\\ \text{mmoles/L.h},á
K_{M,\text{app}} = a\cdot v_{\text{máx,app}} \approx 0{,}3098\cdot6{,}28 \approx 1{,}95\\ \text{mM}.á
Observe que v_{\text{máx,app}}á permaneceu praticamente igual a v_{\text{máx}}á sem inibidor, enquanto K_{M,\text{app}} aumentou (de \approx1{,}23 para \approx1{,}95).

Passo 7

Mesmo procedimento para \;I=1{,}95\\ \text{mM}.
  • Cálculo dos coeficientes:
    a \approx 0{,}4039,\qquad b \approx 0{,}1533.
  • Então:
    v_{\text{máx,app}} = \frac{1}{b} \approx \frac{1}{0{,}1533} \approx 6{,}52\\ \text{mmoles/L.h},á
K_{M,\text{app}} = a\cdot v_{\text{máx,app}} \approx 0{,}4039\cdot6{,}52 \approx 2{,}64\\ \text{mM}.á
Novamente, v_{\text{máx,app}}á está essencialmente inalterado em relação a I=0, enquanto K_{M,\text{app}} aumentou mais.

Passo 8

Interpretação dos resultados para identificar o tipo de inibição.
  • Resumo obtido:
    • v_{\text{máx}}á estimado (para [I]=0,\,1{,}26,\,1{,}95) foi aproximadamente 6{,}34,\;6{,}28,\;6{,}52 (valores muito próximos — variação pequena devido a ruído experimental).
    • K_{M,\text{app}} aumentou com [I]: aproximadamente 1{,}23 \to 1{,}95 \to 2{,}64\\ \text{mM}.
  • Conclusão lógica: quando v_{\text{máx}}á permanece constante e K_{M,\text{app}} aumenta com [I], isso é característico de inibição competitiva.
Portanto, o tipo de inibição é: inibição competitiva.

Passo 9

Cálculo de K_I (constante de dissociação do inibidor) usando a relação para inibição competitiva.
  • Para inibição competitiva vale:
    K_{M,\text{app}} = K_M\Big(1 + \frac{[I]}{K_I}\Big).
    Reorganizando:
    \frac{K_{M,\text{app}}}{K_M} = 1 + \frac{[I]}{K_I} \quad\Rightarrow\quad K_I = \frac{[I]}{\dfrac{K_{M,\text{app}}}{K_M} - 1}.
  • Usando os dois pontos com [I]>0 individualmente dá estimativas ligeiramente diferentes por conta do ruído experimental:
    • Para [I]=1{,}26\\ \text{mM}, com K_M\approx1{,}23 e K_{M,\text{app}}\approx1{,}95: K_I \approx \frac{1{,}26}{\tfrac{1{,}95}{1{,}23} - 1} \approx \frac{1{,}26}{1{,}582 - 1} \approx 2{,}16\\ \text{mM}.
    • Para [I]=1{,}95\\ \text{mM}, com K_{M,\text{app}}\approx2{,}64: K_I \approx \frac{1{,}95}{\tfrac{2{,}64}{1{,}23} - 1} \approx \frac{1{,}95}{2{,}144 - 1} \approx 1{,}71\\ \text{mM}.
  • Para uma estimativa mais robusta, ajustei linearmente K_{M,\text{app}} versus [I] (modelo K_{M,\text{app}} = K_M + \dfrac{K_M}{K_I}[I]). A regressão linear pelos três pontos dá:
    K_M \\ (\text{intercepto}) \approx 1{,}19\\ \text{mM},\qquad \text{declive } m \approx \frac{K_M}{K_I} \approx 0{,}7015.
    Assim
    K_I \approx \frac{K_M}{m} \approx \frac{1{,}19}{0{,}7015} \approx 1{,}69\\ \text{mM}.
  • Tomando uma média ponderada das estimativas e considerando erro experimental, uma boa estimativa final é
    K_I \approx 1{,}7\\ \text{mM}.

Resposta

Inibição competitiva
v_{\text{máx}}\approx 6{,}4\\ \text{mmoles/L.h}á
K_{M}\approx 1{,}2\\ \text{mM}
K_{I}\approx 1{,}7\\ \text{mM}

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