Os seguintes dados foram obtidos para uma reação catalisada por enzimas:
[\mathrm{S}] \mathrm{mol} / \mathrm{L} 5,0 \times 10^{-4} 2,0 \times 10^{-4} 6,0 \times 10^{-5} 4,0 \times 10^{-5} 3,0 \times 10^{-5} 2,0 \times 10^{-5} 1,6 \times 10^{-5} 1,0 \times 10^{-5} 8,0 \times 10^{-6}
v \mu \mathrm{~mol} / \mathrm{min} 125 125 121 111 96,5 62,5 42,7 13,9 7,5
Determine \mathrm{v}_{\text {máx }}á e \mathrm{K}_{\mathrm{M}}. Plote os dados usando o método Eadie-Hofstee. Esses dados se encaixam na cinética de Michaelis-Menten? Porque? Fazer o gráfico e interpretar. Discutir a resposta com a professora e os colegas.

Passo 1

O enunciado pede claramente:
  • Determinar \mathrm{v}_{\text{máx}}á e K_{M} a partir dos dados experimentais fornecidos.
  • Plotar os dados pelo método de Eadie–Hofstee (isto é, gráfico de v versus v/[S]) e interpretar se os dados se encaixam na cinética de Michaelis–Menten, justificando a resposta.
Dados fornecidos (peguei os números do enunciado):
  • Concentrações de substrato [S] em mol/L: \begin{array}{l} [S]=5{,}0\times10^{-4},\\\ 2{,}0\times10^{-4},\\\ 6{,}0\times10^{-5},\\\ 4{,}0\times10^{-5},\\\ \qquad 3{,}0\times10^{-5},\\\ 2{,}0\times10^{-5},\\\ 1{,}6\times10^{-5},\\\ 1{,}0\times10^{-5},\\\ 8{,}0\times10^{-6} \end{array}
  • Velocidades iniciais v em \mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}: v=125,\\\ 125,\\\ 121,\\\ 111,\\\ 96{,}5,\\\ 62{,}5,\\\ 42{,}7,\\\ 13{,}9,\\\ 7{,}5.
O que vou entregar:
  • Aula curta sobre a teoria necessária (Michaelis–Menten e Eadie–Hofstee), explicando cada símbolo.
  • Cálculo passo a passo dos valores transformados v/[S] (com cuidado de unidades).
  • Ajuste linear pelo método dos mínimos quadrados no gráfico Eadie–Hofstee e extração de \mathrm{v}_{\text{máx}}á e K_M.
  • Interpretação do gráfico e avaliação objetiva (com R²) se os dados seguem Michaelis–Menten.

Passo 2

Rápida aula: equação de Michaelis–Menten e linearização Eadie–Hofstee.
  • A equação de Michaelis–Menten diz que a velocidade inicial v depende da concentração de substrato [S] por
v=\dfrac{V_{\max}[S]}{K_{M}+[S]},
onde:
  • V_{\max} é a velocidade máxima alcançável quando a enzima está saturada de substrato;
  • K_{M} é a constante de Michaelis (a concentração de substrato na qual v=V_{\max}/2); unidades de K_M são as mesmas de [S].
  • Eadie–Hofstee: rearranjando a equação obtemos
v = V_{\max} - K_{M}\cdot\frac{v}{[S]}.
Isto é uma equação linear do tipo y = a + b x com:
  • y = v (eixo vertical),
  • x = \dfrac{v}{[S]} (eixo horizontal),
  • intercepto a = V_{\max},
  • coeficiente angular b = -K_{M}.
    Portanto, no gráfico v versus v/[S] a ordenada na origem dá V_{\max} e a inclinação é -K_M.
Observação sobre unidades e prática: para evitar números muito grandes, é comum expressar [S] em \mu\text{M} (micromolar, \mu\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}) quando v está em \mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}. Assim v/[S] tem unidades de \text{L}\cdot\text{min}^{-1} e o valor numérico de K_M ficará em \mu\text{M} (mais legível). Vou fazer essa conversão.

Passo 3

Converter [S] para \mu\text{M} e calcular x=\dfrac{v}{[S]} (com [S] em \mu\text{M}) — passo a passo e tabela auxiliar.
Conversão: 1\\ \text{M}=10^{6}\\ \mu\text{M}. Então os [S] ficam:
[S]=500,\\\ 200,\\\ 60,\\\ 40,\\\ 30,\\\ 20,\\\ 16,\\\ 10,\\\ 8\quad(\mu\text{M}).
Agora calculo x=\dfrac{v}{[S]} (unidades: L·min^{-1}, numericamente \mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}/\mu\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}):
\begin{array}{cccc} [S]\\ (\mu\text{M}) & v\\ (\mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}) & \dfrac{v}{[S]}\\ (\text{L}\cdot\text{min}^{-1})\\hline 500 & 125 & 0{,}250\\\\ 200 & 125 & 0{,}625\\\\ 60 & 121 & 2{,}016666667\\\\ 40 & 111 & 2{,}775\\\\ 30 & 96{,}5 & 3{,}216666667\\\\ 20 & 62{,}5 & 3{,}125\\\\ 16 & 42{,}7 & 2{,}66875\\\\ 10 & 13{,}9 & 1{,}39\\\\ 8 & 7{,}5 & 0{,}9375 \end{array}
Esses são os pontos para o gráfico Eadie–Hofstee: eixo x=\dfrac{v}{[S]} e eixo y=v.

Passo 4

Ajuste linear (mínimos quadrados) para y=v versus x=v/[S]. Vou explicar a fórmula e aplicá-la numericamente.
Fórmulas do ajuste linear:
\text{slope } b=\dfrac{n\sum xy - (\sum x)(\sum y)}{n\sum x^{2} - (\sum x)^{2}}, \qquad \text{intercept } a=\dfrac{\sum y - b\sum x}{n},
onde n é o número de pontos, x=v/[S], y=v.
Cálculos (usei os valores de x e y da tabela):
  • n=9.
  • \sum x \approx 17{,}004583334.
  • \sum y = 705{,}1.
  • \sum xy \approx 1307{,}445375.
  • \sum x^{2} \approx 42{,}2648300345.
Aplicando as fórmulas:
b=\dfrac{9\cdot1307{,}445375 - 17{,}004583334\cdot705{,}1}{9\cdot42{,}2648300345 - (17{,}004583334)^{2}} \approx -2{,}444
a=\dfrac{705{,}1 - (-2{,}444)\cdot17{,}004583334}{9} \approx 82{,}962
Interpretação direta (pela relação Eadie–Hofstee v = V_{\max} - K_{M}\cdot v/[S]):
  • V_{\max}=a\approx 82{,}96\\ \mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}.
  • -K_{M}=b\Rightarrow K_{M}\approx -b \approx 2{,}444\\ \mu\text{M}.
Convertendo K_{M} para mol/L:
K_{M}\approx 2{,}444\\ \mu\text{M}=2{,}444\times10^{-6}\\ \text{mol}\cdot\text{L}^{-1}.
(Comentário didático: a unidade de V_{\max} é a mesma das velocidades medidas, aqui \mu\text{mol}\cdot\text{min}^{-1}. A unidade de K_M é a mesma de [S]; converti para \mu\text{M} por conveniência.)

Passo 5

Avaliação da qualidade do ajuste e se os dados seguem Michaelis–Menten.
  • Uma maneira objetiva é calcular o coeficiente de determinação R^{2}=1-\dfrac{\text{SSE}}{\text{SST}}, onde
    \text{SST}=\sum (y_{i}-\bar{y})^{2} e \text{SSE}=\sum (y_{i}-\hat{y}_{i})^{2} ( \hat{y}_{i} predito pela reta).
  • Fiz os cálculos (mostro o raciocínio resumido): obtive \text{SST}\approx 18262{,}6 e \text{SSE}\approx 18203{,}0, dando R^{2}\approx 1-\dfrac{18203}{18262{,}6}\approx 0{,}0033\\ (\text{ou }0{,}33\%).Isso significa que a reta de Eadie–Hofstee praticamente não explica a variância dos dados — ajuste péssimo.
Observações visuais/interpretativas (como você faria ao traçar o gráfico v vs v/[S]):
  • No gráfico, a reta ajustada tem intercepto em \approx 82{,}96 e inclinação \approx -2{,}444.
  • Muitos pontos experimentais estão longe dessa reta: por exemplo, os dois pontos com v=125 (em [S]=500\\ \mu\text{M} e 200\\ \mu\text{M}) ficam bem acima do intercepto e muito distantes da reta predita.
  • Alguns pontos em baixas concentrações ( [S]=10\\ \mu\text{M} e 8\\ \mu\text{M}) também ficam muito abaixo da reta predita.
Conclusão sobre encaixe Michaelis–Menten:
  • Estatisticamente e visualmente, os dados NÃO se encaixam bem na cinética simples de Michaelis–Menten (R² praticamente zero e grande dispersão dos resíduos).
  • Possíveis causas a discutir com professora/colegas:
    • dados experimentais com erros (ruído, problema na medição de v ou [S]);
    • presença de fenómenos que quebram a hipótese de Michaelis–Menten simples: inibição por substrato, ativação alostérica, múltiplos sítios com cooperatividade, efeitos de produto, condições experimentais (pH, temperatura) variando entre medidas;
    • pontos atípicos/outliers (por exemplo os dois pontos com v=125 parecem inconsistentes com o restante).
  • Recomendação prática: reavaliar experimentos (repetir medidas, checar concentrações), traçar também outras linearizações (Lineweaver–Burk, Hanes–Woolf) e, idealmente, ajustar a equação não-linear original v=\dfrac{V_{\max}[S]}{K_{M}+[S]} por mínimos quadrados não-lineares (ajuste direto) — isto é menos sensível a erros em variáveis transformadas. Mas mesmo o ajuste não-linear provável mostrará desprezo se há outliers ou cinética diferente.
Encerrando: temos uma estimativa a partir do Eadie–Hofstee linear, mas os resíduos e o R^{2} mostram que essa estimativa não é confiável até que se entenda e corrija a origem da grande dispersão dos dados. Vai ser um ótimo ponto de discussão com a professora/colegas: quais pontos repetir, se há controle de condições experimentais, e se a enzima apresenta comportamento não-Michaeliano.

Resposta

V_{\max}\approx 82{,}96\\ \mu\mathrm{mol}\cdot\mathrm{min}^{-1}
K_{M}\approx 2{,}444\\ \mu\mathrm{M} \;=\;2{,}444\times10^{-6}\\ \mathrm{mol}\cdot\mathrm{L}^{-1}
Os dados NÃO se encaixam bem na cinética de Michaelis–Menten (ajuste Eadie–Hofstee com R^{2}\approx0{,}003; grande dispersão/resíduos, indicar rechecagem experimental ou cinética não-Michaeliana).

Exercícios relacionados