A velocidade inicial de uma reação enzimática foi determinada em presença de vários inibidores (A, B e C) em várias concentrações de substrato (S). Os dados da velocidade na ausência e presença desse inibidor estão apresentados na tabela abaixo. Determine o modo de ação de cada inibidor e calcule a constante de inibição \mathrm{K}_{\mathrm{I}} para A , B e C .
S (mM) Velocidade inicial da reação (nmol/min)
Sem inibidor [A] =5 \mu \mathrm{M} [B] =25 \mu \mathrm{M} [C] =0,1 \mathrm{mM}
0,20 8,34 3,15 5,32 4,33
0,33 12,48 5,06 6,26 5,56
0,50 16,67 7,12 7,07 8,75
1,00 25,00 13,30 8,56 14,80
2,50 36,20 26,20 9,45 23,60
4,00 40,00 28,90 9,60 28,50
5,00 42,60 31,80 9,75 30,00

Passo 1

O enunciado pede duas coisas para cada inibidor A, B e C:
  • Identificar o modo de ação (competitivo, não-competitivo, não-competitivo misto, ou não-competitivo uncompetitivo etc.);
  • Calcular a constante de inibição \mathrm{K_I} correspondente.
Informações dadas (peguei todos estes números da tabela enviada):
  • Concentrações de substrato [S] em mM: 0{,}20,\;0{,}33,\;0{,}50,\;1{,}00,\;2{,}50,\;4{,}00,\;5{,}00.
  • Velocidades iniciais (sem inibidor) em nmol/min: 8{,}34,\;12{,}48,\;16{,}67,\;25{,}00,\;36{,}20,\;40{,}00,\;42{,}60.
  • Velocidades iniciais com [A]=5\\ \mu\mathrm{M}: 3{,}15,\;5{,}06,\;7{,}12,\;13{,}30,\;26{,}20,\;28{,}90,\;31{,}80.
  • Velocidades iniciais com [B]=25\\ \mu\mathrm{M}: 5{,}32,\;6{,}26,\;7{,}07,\;8{,}56,\;9{,}45,\;9{,}60,\;9{,}75.
  • Velocidades iniciais com [C]=0{,}1\\ \mathrm{mM}=100\\ \mu\mathrm{M}: 4{,}33,\;5{,}56,\;8{,}75,\;14{,}80,\;23{,}60,\;28{,}50,\;30{,}00.
O objetivo prático será estimar V_{\max} e K_M do sistema sem inibidor e, depois, a partir de transformada de Lineweaver–Burk (recíprocos), comparar as alterações na inclinação e intercepto das retas para cada inibidor, classificar o tipo de inibição e calcular \mathrm{K_I}.

Passo 2

Breve aula-prática (sem pular etapas) sobre as ferramentas que vou usar.
  1. Equação de Michaelis–Menten (forma usual)
v = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_M + [S]},
onde:
  • v é a velocidade inicial medida (nmol/min),
  • V_{\max} é a velocidade máxima (nmol/min),
  • K_M é a constante de Michaelis (mesmas unidades de [S], aqui mM),
  • [S] é a concentração de substrato (mM).
  1. Transformação de Lineweaver–Burk: tomar recíprocos dá uma reta
\frac{1}{v} = \frac{K_M}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}.
Na forma y = m x + b temos:
  • x = \dfrac{1}{[S]},
  • y = \dfrac{1}{v},
  • inclinação m = \dfrac{K_M}{V_{\max}},
  • intercepto vertical b = \dfrac{1}{V_{\max}}.
  1. Como diferentes modos de inibição aparecem no gráfico:
  • Inibição competitiva: as retas (com e sem inibidor) têm o mesmo intercepto b (isto é, V_{\max} inalterado), mas inclinações maiores com inibidor ( K_{M,\text{app}} aumenta).
  • Inibição não-competitiva pura: K_M inalterado e V_{\max} diminui (intercepto b aumenta), a inclinação muda por causa do V_{\max} alterado.
  • Inibição não-competitiva mista (ou simplesmente “misto”): tanto K_M quanto V_{\max} mudam; na Lineweaver as retas se cruzam fora do eixo y.
  • Inibição não-competitiva uncompetitiva: retas são paralelas (mesma inclinação), com interceptos diferentes ( V_{\max} e K_M ambos diminuem proporcionalmente).
  1. Constantes de inibição (usar equações padrão):
  • Para inibição competitiva (A), a relação é
K_{M,\text{app}} = K_M\left(1+\frac{[I]}{K_I}\right),
logo
K_I = \frac{[I]}{\dfrac{K_{M,\text{app}}}{K_M}-1}.
  • Para inibição uncompetitiva (B), V_{\max,\text{app}} = \dfrac{V_{\max}}{1+[I]/K_I}, então
K_I = \frac{[I]}{\dfrac{V_{\max}}{V_{\max,\text{app}}}-1}.
Também pode-se usar K_{M,\text{app}} = \dfrac{K_M}{1+[I]/K_I} para outra estimativa (devem dar valores próximos).
  • Para inibição mista (C) existem duas constantes: K_I (ligação ao E livre) e K_I' (ligação ao complexo ES). Definindo \alpha = 1+\dfrac{[I]}{K_I} e \alpha' = 1+\dfrac{[I]}{K_I'}, a reta de Lineweaver fica
\frac{1}{v} = \frac{\alpha K_M}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[S]} + \frac{\alpha'}{V_{\max}}.
Assim:
\alpha = \frac{m_{\text{inh}}\;V_{\max}}{K_M},\qquad \alpha' = b_{\text{inh}}\;V_{\max},
e então
K_I = \frac{[I]}{\alpha-1},\qquad K_I'=\frac{[I]}{\alpha'-1}.
Observação prática: preciso estimar V_{\max} e K_M do controle primeiro; depois obter inclinações e interceptos (retas) para cada condição e aplicar as fórmulas acima. Vou fazer ajuste linear por mínimos quadrados na transformação recíproca (Lineweaver–Burk) para cada série de dados — descrevo o cálculo e mostro os resultados.

Passo 3

Determinação de V_{\max} e K_M sem inibidor (ajuste Lineweaver–Burk).
Construo os pares \left(\dfrac{1}{[S]},\dfrac{1}{v}\right) a partir da tabela (mostro alguns valores-chave; todos os valores originais foram usados no ajuste):
  • Por exemplo, para [S]=0{,}20\\ \mathrm{mM}, \dfrac{1}{[S]}=5{,}00\\ \mathrm{mM}^{-1} e para v=8{,}34 nmol/min, \dfrac{1}{v}=0{,}1199\\ \mathrm{(min/nmol)}. Fiz isso para os sete pontos.
Ajuste linear (mínimos quadrados) aos dados recíprocos deu (coeficientes da reta)
\frac{1}{v} = m_{\text{ctrl}}\cdot\frac{1}{[S]} + b_{\text{ctrl}}
com valores numéricos obtidos
m_{\text{ctrl}} = 0{,}02002,\qquad b_{\text{ctrl}} = 0{,}01977.
A partir disso:
V_{\max} = \frac{1}{b_{\text{ctrl}}} \approx \frac{1}{0{,}01977} \approx 50{,}57\\ \text{nmol/min},
K_M = m_{\text{ctrl}}\cdot V_{\max} \approx 0{,}02002\times50{,}57 \approx 1{,}01\\ \text{mM}.
Comentário amigável: esses valores vêm do ajuste linear dos recíprocos; conferi que fazem sentido com os dados (por exemplo, com esses valores a velocidade prevista para [S]=5{,}0\\ \mathrm{mM} fica próxima de 42 nmol/min, coerente com a tabela).

Passo 4

Análise do inibidor A ( [A]=5\\ \mu\mathrm{M}) — ajuste Lineweaver–Burk e classificação.
  1. Ajuste linear (mesmo procedimento) aos recíprocos dos dados com A resultou em
m_{A} = 0{,}05993,\qquad b_{A} = 0{,}01757.
  1. A partir disso:
V_{\max,\text{app}}^{(A)} = \frac{1}{b_A} \approx \frac{1}{0{,}01757} \approx 56{,}9\\ \text{nmol/min},
K_{M,\text{app}}^{(A)} = m_A\cdot V_{\max,\text{app}}^{(A)} \approx 0{,}05993\times56{,}9 \approx 3{,}41\\ \text{mM}.
Interpretação:
  • V_{\max} estimado com A ficou aproximadamente da mesma ordem do controle (50,6 versus 56,9, pequena variação atribuível ao ruído/ajuste), enquanto K_M aumentou de 1{,}01 mM para 3{,}41 mM. Esse padrão (Vmax praticamente inalterado, Km aumentado) é característico de inibição competitiva.
Cálculo de \mathrm{K_I} para A (inibidor competitivo):
  • Usando [I]=5\\ \mu\mathrm{M}. Converter K_M para as mesmas unidades relativas não é estritamente necessário no fator, mas para clareza converto Km em μM:
K_M = 1{,}01\\ \mathrm{mM} = 1010\\ \mu\mathrm{M},\qquad K_{M,\text{app}}^{(A)} = 3{,}41\\ \mathrm{mM} = 3410\\ \mu\mathrm{M}.
Aplicando
K_I = \frac{[I]}{\dfrac{K_{M,\text{app}}}{K_M}-1} = \frac{5}{\dfrac{3410}{1010}-1}\\ \mu\mathrm{M} = \frac{5}{3{,}376-1}\\ \mu\mathrm{M} \approx \frac{5}{2{,}376}\\ \mu\mathrm{M} \approx 2{,}11\\ \mu\mathrm{M}.
Conclusão para A: inibidor competitivo; K_I^{(A)} \approx 2{,}11\\ \mu\mathrm{M}.

Passo 5

Análise do inibidor B ( [B]=25\\ \mu\mathrm{M}) — ajuste e classificação.
  1. Ajuste linear (Lineweaver) para B deu
m_{B} = 0{,}01840,\qquad b_{B} = 0{,}10002.
  1. A partir disso:
V_{\max,\text{app}}^{(B)} = \frac{1}{b_B} \approx \frac{1}{0{,}10002} \approx 10{,}00\\ \text{nmol/min},
K_{M,\text{app}}^{(B)} = m_B\cdot V_{\max,\text{app}}^{(B)} \approx 0{,}01840\times10{,}00 \approx 0{,}184\\ \text{mM}.
Interpretação:
  • Comparando com o controle ( V_{\max}=50{,}57, K_M=1{,}01 mM), nota-se que tanto V_{\max} quanto K_M diminuíram (para B: V_{\max} pequeno ≈ 10 e K_M 0{,}184 mM). Além disso o valor da inclinação m do B é muito parecido com a do controle (0{,}0184 vs 0{,}0200), o que indica retas quase paralelas — isso é comportamento típico de inibição uncompetitiva (o inibidor liga ao complexo ES e reduz V_{\max} e K_M na mesma proporção).
Cálculo de \mathrm{K_I} para B (inibidor uncompetitivo):
  • Usando a relação via V_{\max}:
\alpha' = 1+\frac{[I]}{K_I} = \frac{V_{\max}}{V_{\max,\text{app}}} \approx \frac{50{,}57}{10{,}00} \approx 5{,}057.
Logo
K_I = \frac{[I]}{\alpha' - 1} = \frac{25}{5{,}057 - 1}\\ \mu\mathrm{M} = \frac{25}{4{,}057}\\ \mu\mathrm{M} \approx 6{,}16\\ \mu\mathrm{M}.
  • Usando a relação via K_M (verificação):
\alpha' = \frac{K_M}{K_{M,\text{app}}} \approx \frac{1{,}01}{0{,}184} \approx 5{,}50,
o que daria
K_I \approx \frac{25}{5{,}50-1} \approx \frac{25}{4{,}50} \approx 5{,}56\\ \mu\mathrm{M}.
As duas estimativas estão próximas; diferenças ocorrem por ruído/ajuste. Uma boa estimativa média fica em torno de K_I^{(B)} \approx 5{,}9\\ \mu\mathrm{M}.
Conclusão para B: inibidor uncompetitivo; K_I^{(B)} \approx 5{,}9\\ \mu\mathrm{M} (estimativa média).

Passo 6

Análise do inibidor C ( [C]=0{,}1\\ \mathrm{mM}=100\\ \mu\mathrm{M}) — ajuste e classificação (misto) e cálculo das constantes.
  1. Ajuste linear para C deu
m_{C} = 0{,}04332,\qquad b_{C} = 0{,}02694.
  1. A partir disso:
V_{\max,\text{app}}^{\text{(C)}} = \frac{1}{b_C} \approx \frac{1}{0{,}02694} \approx 37{,}13\\ \text{nmol/min},
K_{M,\text{app}}^{\text{(C)}} = m_C\cdot V_{\max,\text{app}}^{\text{(C)}} \approx 0{,}04332\times37{,}13 \approx 1{,}61\\ \text{mM}.
Interpretação:
  • Aqui V_{\max} diminuiu (de 50{,}57 para 37{,}13 nmol/min) e K_M aumentou (de 1{,}01 para 1{,}61 mM). Esse padrão (ambos mudam, sem cair na forma da inibição uncompetitiva ou competitiva pura) é consistente com inibição mista. Em inibição mista usamos os fatores \alpha e \alpha':
  1. Calcular \alpha e \alpha' e então K_I e K_I'.
Usando o controle V_{\max}=50{,}57 e K_M=1{,}01 mM:
  • \alpha' = b_C\;V_{\max} \approx 0{,}02694\times50{,}57 \approx 1{,}362.
  • \alpha = \dfrac{m_C\;V_{\max}}{K_M} \approx \dfrac{0{,}04332\times50{,}57}{1{,}01} \approx \dfrac{2{,}190}{1{,}01} \approx 2{,}164.
Agora as constantes:
K_I = \frac{[I]}{\alpha - 1} = \frac{100\\ \mu\mathrm{M}}{2{,}164 - 1} \approx \frac{100}{1{,}164}\\ \mu\mathrm{M} \approx 85{,}9\\ \mu\mathrm{M},
K_I' = \frac{[I]}{\alpha' - 1} = \frac{100\\ \mu\mathrm{M}}{1{,}362 - 1} \approx \frac{100}{0{,}362}\\ \mu\mathrm{M} \approx 276{,}5\\ \mu\mathrm{M}.
Interpretação final: O inibidor C é de modo misto (preferencialmente liga ao E livre com afinidade maior que ao ES, pois K_I menor que K_I'). Para relatório final geralmente se reporta K_I (ligação ao E livre); K_I\approx85{,}9\\ \mu\mathrm{M}. Também reportei K_I'\approx276{,}5\\ \mu\mathrm{M} para a ligação ao complexo ES.

Passo 7

Resumo das classificações e valores numéricos (valores arredondados com duas cifras significativas quando apropriado). Justificativas e fórmulas foram mostradas nos passos anteriores; aqui ficam os resultados consolidados.

Resposta

A — modo: inibidor competitivo; K_I^{(A)} \approx 2{,}11\\ \mu\mathrm{M}
B — modo: inibidor uncompetitivo; K_I^{(B)} \approx 5{,}9\\ \mu\mathrm{M}
C — modo: inibidor misto; K_I^{\text{(C)}} \approx 85{,}9\\ \mu\mathrm{M} (ligação ao E livre).
(opcional: constante para ligação ao complexo ES para C: K_I' \approx 276{,}5\\ \mu\mathrm{M}).

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