A velocidade inicial de uma reação enzimática foi determinada em presença de vários inibidores (A, B e C) em várias concentrações de substrato (S). Os dados da velocidade na ausência e presença desse inibidor estão apresentados na tabela abaixo. Determine o modo de ação de cada inibidor e calcule a constante de inibição
para A , B e C .
S (mM)
Velocidade inicial da reação (nmol/min)
Sem inibidor
[A]
[B]
[C]
0,20
8,34
3,15
5,32
4,33
0,33
12,48
5,06
6,26
5,56
0,50
16,67
7,12
7,07
8,75
1,00
25,00
13,30
8,56
14,80
2,50
36,20
26,20
9,45
23,60
4,00
40,00
28,90
9,60
28,50
5,00
42,60
31,80
9,75
30,00
| S (mM) | Velocidade inicial da reação (nmol/min) | |||
| Sem inibidor | [A]
|
[B]
|
[C]
|
|
| 0,20 | 8,34 | 3,15 | 5,32 | 4,33 |
| 0,33 | 12,48 | 5,06 | 6,26 | 5,56 |
| 0,50 | 16,67 | 7,12 | 7,07 | 8,75 |
| 1,00 | 25,00 | 13,30 | 8,56 | 14,80 |
| 2,50 | 36,20 | 26,20 | 9,45 | 23,60 |
| 4,00 | 40,00 | 28,90 | 9,60 | 28,50 |
| 5,00 | 42,60 | 31,80 | 9,75 | 30,00 |
Passo 1
O enunciado pede duas coisas para cada inibidor A, B e C:
- Identificar o modo de ação (competitivo, não-competitivo, não-competitivo misto, ou não-competitivo uncompetitivo etc.);
- Calcular a constante de inibição
correspondente.
Informações dadas (peguei todos estes números da tabela enviada):
- Concentrações de substrato
em mM: . - Velocidades iniciais (sem inibidor) em nmol/min:
. - Velocidades iniciais com
: . - Velocidades iniciais com
: . - Velocidades iniciais com
: .
O objetivo prático será estimar
e
do sistema sem inibidor e, depois, a partir de transformada de Lineweaver–Burk (recíprocos), comparar as alterações na inclinação e intercepto das retas para cada inibidor, classificar o tipo de inibição e calcular
.
Passo 2
Breve aula-prática (sem pular etapas) sobre as ferramentas que vou usar.
- Equação de Michaelis–Menten (forma usual)
onde:
-
é a velocidade inicial medida (nmol/min), -
é a velocidade máxima (nmol/min), -
é a constante de Michaelis (mesmas unidades de , aqui mM), -
é a concentração de substrato (mM).
- Transformação de Lineweaver–Burk: tomar recíprocos dá uma reta
Na forma
temos:
-
, -
, - inclinação
, - intercepto vertical
.
- Como diferentes modos de inibição aparecem no gráfico:
- Inibição competitiva: as retas (com e sem inibidor) têm o mesmo intercepto
(isto é, inalterado), mas inclinações maiores com inibidor ( aumenta). - Inibição não-competitiva pura:
inalterado e diminui (intercepto aumenta), a inclinação muda por causa do alterado. - Inibição não-competitiva mista (ou simplesmente “misto”): tanto
quanto mudam; na Lineweaver as retas se cruzam fora do eixo . - Inibição não-competitiva uncompetitiva: retas são paralelas (mesma inclinação), com interceptos diferentes (
e ambos diminuem proporcionalmente).
- Constantes de inibição (usar equações padrão):
- Para inibição competitiva (A), a relação é
logo
- Para inibição uncompetitiva (B),
, então
Também pode-se usar
para outra estimativa (devem dar valores próximos).
- Para inibição mista (C) existem duas constantes:
(ligação ao E livre) e (ligação ao complexo ES). Definindo e , a reta de Lineweaver fica
Assim:
e então
Observação prática: preciso estimar
e
do controle primeiro; depois obter inclinações e interceptos (retas) para cada condição e aplicar as fórmulas acima. Vou fazer ajuste linear por mínimos quadrados na transformação recíproca (Lineweaver–Burk) para cada série de dados — descrevo o cálculo e mostro os resultados.
Passo 3
Determinação de
e
sem inibidor (ajuste Lineweaver–Burk).
Construo os pares
a partir da tabela (mostro alguns valores-chave; todos os valores originais foram usados no ajuste):
- Por exemplo, para
, e para nmol/min, . Fiz isso para os sete pontos.
Ajuste linear (mínimos quadrados) aos dados recíprocos deu (coeficientes da reta)
com valores numéricos obtidos
A partir disso:
Comentário amigável: esses valores vêm do ajuste linear dos recíprocos; conferi que fazem sentido com os dados (por exemplo, com esses valores a velocidade prevista para
fica próxima de
nmol/min, coerente com a tabela).
Passo 4
Análise do inibidor A (
) — ajuste Lineweaver–Burk e classificação.
- Ajuste linear (mesmo procedimento) aos recíprocos dos dados com A resultou em
- A partir disso:
Interpretação:
-
estimado com A ficou aproximadamente da mesma ordem do controle (50,6 versus 56,9, pequena variação atribuível ao ruído/ajuste), enquanto aumentou de mM para mM. Esse padrão (Vmax praticamente inalterado, Km aumentado) é característico de inibição competitiva.
Cálculo de
para A (inibidor competitivo):
- Usando
. Converter para as mesmas unidades relativas não é estritamente necessário no fator, mas para clareza converto Km em μM:
Aplicando
Conclusão para A: inibidor competitivo;
.
Passo 5
Análise do inibidor B (
) — ajuste e classificação.
- Ajuste linear (Lineweaver) para B deu
- A partir disso:
Interpretação:
- Comparando com o controle (
, mM), nota-se que tanto quanto diminuíram (para B: pequeno ≈ e ≈ mM). Além disso o valor da inclinação do B é muito parecido com a do controle (0{,}0184 vs 0{,}0200), o que indica retas quase paralelas — isso é comportamento típico de inibição uncompetitiva (o inibidor liga ao complexo ES e reduz e na mesma proporção).
Cálculo de
para B (inibidor uncompetitivo):
- Usando a relação via
:
Logo
- Usando a relação via
(verificação):
o que daria
As duas estimativas estão próximas; diferenças ocorrem por ruído/ajuste. Uma boa estimativa média fica em torno de
.
Conclusão para B: inibidor uncompetitivo;
(estimativa média).
Passo 6
Análise do inibidor C (
) — ajuste e classificação (misto) e cálculo das constantes.
- Ajuste linear para C deu
- A partir disso:
Interpretação:
- Aqui
diminuiu (de para nmol/min) e aumentou (de para mM). Esse padrão (ambos mudam, sem cair na forma da inibição uncompetitiva ou competitiva pura) é consistente com inibição mista. Em inibição mista usamos os fatores e :
- Calcular
e e então e .
Usando o controle
e
mM:
Agora as constantes:
Interpretação final: O inibidor C é de modo misto (preferencialmente liga ao E livre com afinidade maior que ao ES, pois
menor que
). Para relatório final geralmente se reporta
(ligação ao E livre);
. Também reportei
para a ligação ao complexo ES.
Passo 7
Resumo das classificações e valores numéricos (valores arredondados com duas cifras significativas quando apropriado). Justificativas e fórmulas foram mostradas nos passos anteriores; aqui ficam os resultados consolidados.
Resposta
A — modo: inibidor competitivo;
B — modo: inibidor uncompetitivo;
C — modo: inibidor misto; (ligação ao E livre).
B — modo: inibidor uncompetitivo;
C — modo: inibidor misto;
(opcional: constante para ligação ao complexo ES para C:
).