Em efluente, a oxidação biológica do ácido fenilacético é inibida pelo ácido propiônico presente neste. Os seguintes dados foram obtidos para a oxidação enzimática do ácido fenilacético em diferentes concentrações de ácido propiônico. a) Que tipo de inibição é essa? b) Determine \mathrm{v}_{\text {máx }} \mathrm{e} \mathrm{K}_{\mathrm{M}}á.
\mathrm{S}(\mathrm{mM}) 0,25 0,40 0,50 0,60 0,75 1,00
v(\mathrm{mM} / \mathrm{L} . \mathrm{h}), \mathrm{I}=0 1,0 1,7 1,9 2,1 2,4 2,5
v(\mathrm{mM} / \mathrm{L} . \mathrm{h}), \mathrm{I}=1 \mathrm{mM} 0,65 1,1 1,3 1,4 1,8 2,2
v(\mathrm{mM} / \mathrm{L} . \mathrm{h}), \mathrm{I}=2 \mathrm{mM} 0,55 0,9 1,0 1,3 1,4 1,8

Passo 1

O enunciado pede duas coisas:
  1. Identificar que tipo de inibição o ácido propiônico causa na oxidação (enzimática) do ácido fenilacético.
  2. Determinar os parâmetros cinéticos da enzima sem inibidor: \mathrm{v}_{\max} e K_M.
Dados fornecidos (extraídos da tabela do enunciado):
\begin{array}{c|cccccc} S\;(\text{mM}) & 0{,}25 & 0{,}40 & 0{,}50 & 0{,}60 & 0{,}75 & 1{,}00\\hline v\;(\text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}),\; I=0 & 1{,}0 & 1{,}7 & 1{,}9 & 2{,}1 & 2{,}4 & 2{,}5\\\ v\;(\text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}),\; I=1{,}0\\ \text{mM} & 0{,}65 & 1{,}1 & 1{,}3 & 1{,}4 & 1{,}8 & 2{,}2\\\ v\;(\text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}),\; I=2{,}0\\ \text{mM} & 0{,}55 & 0{,}9 & 1{,}0 & 1{,}3 & 1{,}4 & 1{,}8 \end{array}
Resumo do que preciso fazer: decidir o tipo de inibição comparando como v muda com I para diferentes S; calcular \mathrm{v}_{\max} e K_M (valores da enzima sem inibidor, i.e., para I=0).

Passo 2

Breve revisão didática (o que vou usar e por quê).
  • A equação de Michaelis–Menten é
v=\frac{\mathrm{v}_{\max}\,S}{K_M+S},
onde v é a velocidade inicial, S é a concentração de substrato, \mathrm{v}_{\max} é a velocidade máxima quando a enzima está saturada e K_M é a constante de Michaelis (concentração de substrato em que v=\mathrm{v}_{\max}/2).
  • Para obter \mathrm{v}_{\max} e K_M a partir de dados experimentais podemos linearizar a equação. Existem várias linearizações (Lineweaver–Burk, Hanes–Woolf, Eadie–Hofstee). Vou usar a forma Eadie–Hofstee porque tende a ser menos influenciada por erros grandes em pontos de baixa concentração e resulta numa regressão linear simples:
v = -K_M\cdot\left(\frac{v}{S}\right) + \mathrm{v}_{\max}.
Nessa forma fazemos a regressão linear de y=v contra x=\dfrac{v}{S}. A inclinação m da reta é -K_M e o intercepto b é \mathrm{v}_{\max}.
  • Para identificar o tipo de inibição qualitativamente: em inibição competitiva o inibidor aumenta o K_M aparente (diminui afinidade aparente) enquanto \mathrm{v}_{\max} não muda; em inibição não-competitiva \mathrm{v}_{\max} diminui enquanto K_M permanece aproximadamente constante; em inibição incompleta (uncompetitive) ambos diminuem. Outra forma prática: em inibição competitiva o efeito do inibidor diminui quando S é grande (i.e., as velocidades com e sem inibidor se aproximam ao aumentar S).

Passo 3

Preparação dos dados para a regressão Eadie–Hofstee (calcular x=\dfrac{v}{S} e y=v para cada medição). Vou mostrar os cálculos para cada condição de inibidor.
Para I=0:
\begin{array}{c|cccccc} S & 0{,}25 & 0{,}40 & 0{,}50 & 0{,}60 & 0{,}75 & 1{,}00\\hline v & 1{,}0 & 1{,}7 & 1{,}9 & 2{,}1 & 2{,}4 & 2{,}5\\hline \displaystyle\frac{v}{S} & 4{,}00 & 4{,}25 & 3{,}80 & 3{,}50 & 3{,}20 & 2{,}50 \end{array}
Para I=1{,}0\\ \text{mM}:
\begin{array}{c|cccccc} S & 0{,}25 & 0{,}40 & 0{,}50 & 0{,}60 & 0{,}75 & 1{,}00\\hline v & 0{,}65 & 1{,}1 & 1{,}3 & 1{,}4 & 1{,}8 & 2{,}2\\hline \displaystyle\frac{v}{S} & 2{,}60 & 2{,}75 & 2{,}60 & 2{,}333\ldots & 2{,}40 & 2{,}20 \end{array}
Para I=2{,}0\\ \text{mM}:
\begin{array}{c|cccccc} S & 0{,}25 & 0{,}40 & 0{,}50 & 0{,}60 & 0{,}75 & 1{,}00\\hline v & 0{,}55 & 0{,}9 & 1{,}0 & 1{,}3 & 1{,}4 & 1{,}8\\hline \displaystyle\frac{v}{S} & 2{,}20 & 2{,}25 & 2{,}00 & 2{,}166\ldots & 1{,}866\ldots & 1{,}80 \end{array}
Esses são os pares (x=\tfrac{v}{S},\; y=v) que vou usar para regressão linear em cada condição de I.

Passo 4

Regressão linear Eadie–Hofstee para I=0 (detalhando somas e fórmulas).
Queremos ajustar y = m x + b com m=-K_M e b=\mathrm{v}_{\max}.
Dados (para I=0):
x = [4{,}00,\;4{,}25,\;3{,}80,\;3{,}50,\;3{,}20,\;2{,}50]
y = [1{,}0,\;1{,}7,\;1{,}9,\;2{,}1,\;2{,}4,\;2{,}5]
Calculemos as somas necessárias (n = 6):
\begin{aligned} \sum x &= 21{,}25,\\\ \sum y &= 11{,}6,\\\ \sum xy &= 39{,}725,\\\ \sum x^2 &= 77{,}2425. \end{aligned}
Fórmulas da regressão:
m=\frac{n\sum xy - (\sum x)(\sum y)}{n\sum x^2 - (\sum x)^2},\qquad b=\frac{\sum y - m\sum x}{n}.
Substituindo:
m=\frac{6\cdot 39{,}725 - 21{,}25\cdot 11{,}6}{6\cdot 77{,}2425 - (21{,}25)^2} =\frac{-8{,}15}{11{,}8925}\approx -0{,}6855.
b=\frac{11{,}6 - (-0{,}6855)\cdot 21{,}25}{6}\approx 4{,}3622.
Interpretação:
-K_M = m \Rightarrow K_M \approx 0{,}6855\\ \text{mM}, \quad \mathrm{v}_{\max}=b\approx 4{,}3622\\ \text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}.

Passo 5

Regressões Eadie–Hofstee para I=1{,}0\\ \text{mM} e I=2{,}0\\ \text{mM} (o objetivo aqui é ver a tendência para identificar o tipo de inibição).
Para I=1{,}0\\ \text{mM}:
x=[2{,}6,\;2{,}75,\;2{,}6,\;2{,}333\ldots,\;2{,}4,\;2{,}2],
y=[0{,}65,\;1{,}1,\;1{,}3,\;1{,}4,\;1{,}8,\;2{,}2].
Cálculos (resumidos):
\begin{aligned} \sum x &\approx 14{,}883333333,\\\ \sum y &= 8{,}45,\\\ \sum xy &\approx 20{,}521666666,\\\ \sum x^2 &\approx 37{,}126944444. \end{aligned}
Aplicando a regressão obtemos (detalhes algébricos como no passo anterior):
m\approx -2{,}110,\qquad b\approx 6{,}6447.
Assim:
K_M^{\text{(apparent)},\;I=1}\approx 2{,}110\\ \text{mM},\qquad \mathrm{v}_{\max}^{\text{(apparent)},\;I=1}\approx 6{,}6447\\ \text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}.
Para I=2{,}0\\ \text{mM}:
x=[2{,}2,\;2{,}25,\;2{,}0,\;2{,}166\ldots,\;1{,}866\ldots,\;1{,}8],
y=[0{,}55,\;0{,}9,\;1{,}0,\;1{,}3,\;1{,}4,\;1{,}8].
Cálculos (resumidos):
\begin{aligned} \sum x &\approx 12{,}283333334,\\\ \sum y &= 6{,}95,\\\ \sum xy &\approx 13{,}905,\\\ \sum x^2 &\approx 25{,}321388888. \end{aligned}
Regressão:
m\approx -1{,}8506,\qquad b\approx 4{,}9475.
Assim:
K_M^{\text{(apparent)},\;I=2}\approx 1{,}8506\\ \text{mM},\qquad \mathrm{v}_{\max}^{\text{(apparent)},\;I=2}\approx 4{,}9475\\ \text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}.
Observação didática rápida sobre incertezas: estimativas de K_M e \mathrm{v}_{\max} a partir de linearizações têm erro experimental; diferentes linearizações podem dar números ligeiramente diferentes. O importante é a tendência relativa entre condições (como I muda K_M aparente e \mathrm{v}_{\max} aparente).

Passo 6

Análise das tendências para identificar o tipo de inibição:
  • Valores obtidos (resumo): \begin{aligned} I=0 &: &K_M &\approx 0{,}686\\ \text{mM},\quad \mathrm{v}_{\max}\approx 4{,}362\\ ;\\\ I=1 &: &K_M^{\text{app}} &\approx 2{,}110\\ \text{mM},\quad \mathrm{v}_{\max}^{\text{app}}\approx 6{,}645\\ ;\\\ I=2 &: &K_M^{\text{app}} &\approx 1{,}851\\ \text{mM},\quad \mathrm{v}_{\max}^{\text{app}}\approx 4{,}948\\ . \end{aligned}
  • Observação qualitativa direta nos dados brutos: ao aumentar S a influência do inibidor diminui (por exemplo, razão v(I)/v(0) cresce com S: em S=0{,}25 temos 0{,}65/1{,}0=0{,}65, enquanto em S=1{,}00 temos 2{,}2/2{,}5=0{,}88). Isso é a marca registrada da inibição competitiva: o inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo, então aumentando S a competição é vencida e a velocidade se aproxima da condição sem inibidor.
  • Interpretação: apesar de variações nas estimativas numéricas de \mathrm{v}_{\max} (devidas a ruído experimental e limitações da linearização), a tendência mais clara é um aumento do K_M aparente quando o inibidor está presente (ou seja, afinidade aparente menor), enquanto o efeito do inibidor diminui ao aumentar S. Esses fatos indicam inibição de caráter competitivo.
Portanto, concluo que a inibição é do tipo competitivo.

Passo 7

Conclusão numérica final (valores que proponho como resposta prática para os parâmetros da enzima sem inibidor, obtidos pela regressão Eadie–Hofstee nos dados I=0):
\boxed{K_M \approx 0{,}686\\ \text{mM},\qquad \mathrm{v}_{\max}\approx 4{,}36\\ \text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}.}
Dica prática para prova: para decidir o tipo de inibição rapidamente em prova sem muitos cálculos, compare as velocidades relativas v(I)/v(0) em baixa e alta [S]. Se a inibição for menor em altas [S] (razão mais próxima de 1), é competitiva. Para extrair K_M e \mathrm{v}_{\max} utilize Eadie–Hofstee v vs v/S (slope -K_M, intercept \mathrm{v}_{\max} ) quando os dados de baixa [S] forem ruidosos — isso geralmente dá estimativas robustas em provas.

Resposta

a) Inibição competitiva.
b) \mathrm{v}_{\max}\approx 4{,}36\\ \text{mM}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{h}^{-1}
K_M\approx 0{,}686\\ \text{mM}

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