2- (valor 7,5 pontos) Supondo-se a análise por cromatografia liquida de alta eficiéncia de 3 compostos F, G e H cujos os pKas såo 4, 5 e 7 respectivamente. Suponha ainda que a separação tenha ocorrido mediante o uso de uma coluna de
, eluida a
a
com acetonitrila
VN mais tampåo de acetato de sódio (
), vazão de fase móvel
, fase estacionária apolar com tamanho de particula de
e detector UV do tipo arranjo de diodos. Responda os itens abaixo:
a) Sabendo-se que o composto H tem caracteristica menos hidrofóbica do que o composto G , esboce um cromatograma indicando a ordem de saida para cada analito.
b) Justifique a ordem de saida de cada composto
c) Se o tamanho da particula da fase estacionária apolar for aumentado de 1,0 para
, mantendo-se demais variáveis constantes, a eficiência de separaçåo irá aumentar ou diminuir? Justifique.
d) Explique a diferença entre eluição isocrática e eluiçâo por gradiente.
e) Qual a vantagem da deteç̧ão UV por arranjo de diodos em comparação ao detector UV fixo?
a) Sabendo-se que o composto H tem caracteristica menos hidrofóbica do que o composto G , esboce um cromatograma indicando a ordem de saida para cada analito.
b) Justifique a ordem de saida de cada composto
c) Se o tamanho da particula da fase estacionária apolar for aumentado de 1,0 para
d) Explique a diferença entre eluição isocrática e eluiçâo por gradiente.
e) Qual a vantagem da deteç̧ão UV por arranjo de diodos em comparação ao detector UV fixo?
Passo 1
Primeiro vamos organizar direitinho o que o enunciado fornece (vou pegar literalmente os valores que você deu e apontar uma pequena inconsistência que aparece no texto):
- Coluna:
(ou seja, diâmetro interno e comprimento ). - Composição da fase móvel:
(v/v) de acetonitrila + tampão acetato de sódio a . - Temperatura:
. - Dois valores de vazão aparecem no enunciado: “eluida a
” e também “vazão de fase móvel ”. Há uma contradição aqui — vou escolher usar porque é a vazão típica para uma coluna de de diâmetro (explico isso brevemente mais adiante). Se a prova usar o outro valor, a ideia qualitativa das respostas não muda, apenas os tempos de retenção mudariam. - Fase estacionária: apolar (coluna reversa; C18 ou equivalente) com tamanho de partícula dado como
(situação inicial). - Detectoração: UV por arranjo de diodos (DAD).
- pKa dos compostos:
, , . - Informação adicional dada no enunciado: “o composto H tem característica menos hidrofóbica do que o composto G” (usar isso para orientação).
O enunciado pede os itens (a) a (e). No passo seguinte eu começo a resolver e a explicar a teoria necessária para entender cada item.
Passo 2
Primeira decisão teórica necessária (e importante para a ordem de eluição): que tipo de compostos são
?
- Se fossem ácidos (pKa referindo-se ao ácido), então a relação ionização × pH seria diferente e a conclusão sobre hidrofobicidade poderia ficar incompatível com a frase do enunciado.
- Como o enunciado diz explicitamente que
é menos hidrofóbico que , isso é consistente com que esses compostos sejam bases fracas (pKs referem-se às suas bases conjugadas): para bases fracas vale que, se , a base está majoritariamente protonada (carregada, mais hidrofílica); se , a base está majoritariamente neutra (mais hidrofóbica).
Portanto vou assumir que os três são bases fracas (por exemplo aminas) e que os valores desão os dos seus ácidos conjugados. Essa hipótese é coerente com a informação dada sobre e .
Explicação curta do porquê: em cromatografia reversa (fase estacionária apolar) a espécie neutra é, em geral, mais retida (mais hidrofóbica) que a espécie carregada, que prefere ficar na fase aquosa e sai primeiro.
Passo 3
Agora uma ferramenta básica que vamos usar várias vezes: a relação de Henderson–Hasselbalch para bases (fração protonada). Para uma base fraca
com
do seu ácido conjugado, a fração protonada (ou seja, fração carregada
) é dada por
- Aqui
é a fração da forma protonada (carregada). - A fração neutra é
.
Esses números nos dizem quão “hidrofílica” (carregada) ou “hidrofóbica” (neutra) cada composto será na condição de.
Vamos calcular para cada composto, passo a passo (uso
):
Para
(
):
Logo a fração neutra de
é
— praticamente todo
está protonado (carregado) e, portanto, hidrofílico.
Para
(
):
A fração neutra de
é
: parte significativa está protonada (hidrofílica), parte neutra (hidrofóbica).
Para
(
):
A fração neutra de
é
— a maior parte de
está neutra e, portanto, relativamente mais hidrofóbica.
Resumo numérico (aproximações):
-
: , neutro (muito hidrofílico). -
: , neutro (intermediário). -
: , neutro (mais hidrofóbico).
Conclusão lógica: a ordem de hidrofobicidade (mais hidrofóbico → menos hidrofóbico) é
Passo 4
Interpretação para cromatografia reversa (RP-HPLC):
- Em RP-HPLC a fase estacionária é apolar; compostos mais hidrofóbicos tendem a interagir mais com a fase estacionária e, portanto, têm tempos de retenção maiores (elutam mais tarde). Compostos mais hidrofílicos preferem a fase móvel aquosa e eluem primeiro.
- Com os números do passo anterior,
é o mais neutro (portanto o mais hidrofóbico) e ficará retido por mais tempo; é intermediário; é quase totalmente protonado e muito hidrofílico, sairá primeiro.
Assim a ordem de saída (do primeiro pico ao último) será:
Esboço verbal do cromatograma (e o que desenhar na prova):
- No eixo
: tempo; eixo : sinal do detector UV. - Primeira subida/peak suave em tempo pequeno:
(pico com menor tempo de retenção). - Depois, um pico em tempo intermediário:
. - Por fim, um pico mais tardio e tipicamente mais largo (se houver menor eficiência) correspondente a
.
Observação: a composição da fase móvel (
acetonitrila) é relativamente forte para RP — isso tende a reduzir os tempos de retenção absolutos de todos, mas NÃO muda a ordem relativa baseada na carga/hidrofobicidade.
Passo 5
Resposta à parte (c): efeito do aumento do tamanho de partícula de
para
- Conceito de eficiência de coluna: costuma-se quantificar por número de placas teóricas
, com
onde
é o comprimento da coluna e
é a altura equivalente a uma placa. Uma coluna “mais eficiente” tem
menor e, portanto,
maior — picos mais estreitos e melhor resolução.
- A dependência do tamanho de partícula com
aparece na teoria (e empiricamente): partículas menores reduzem os termos relacionados à difusão e à dispersão de caminhos (termo A de eddy diffusion) e permitem um menor , logo maior . De forma prática, aumenta quando o diâmetro das partículas diminui; uma regra empírica é que é aproximadamente inversamente proporcional a (ou seja, reduzir aumenta bastante ). - Portanto, se o tamanho de partícula aumenta de
para , a eficiência de separação diminuirá — os picos ficam mais largos, a resolução entre picos cai e fica mais difícil separar analitos próximos.
Observação prática: a vantagem de partículas maiores é menor contrapressão; vantagem de partículas menores é maior eficiência (mas com aumento da pressão). A escolha é sempre um compromisso entre eficiência e pressão/robustez.
Passo 6
Resposta à parte (d): diferença entre eluição isocrática e por gradiente
- Eluição isocrática: a composição da fase móvel é mantida constante durante toda a corrida (por exemplo sempre
acetonitrila + tampão). Simples, fácil de equilibrar a coluna, boa para misturas simples e quantificação reprodutível. Em isocrático, compostos muito retidos podem dar tempos de análise longos e picos largos. - Eluição por gradiente: a composição da fase móvel varia ao longo do tempo (por exemplo aumenta-se a fração orgânica de
para ao longo de vários minutos). Muito útil quando a mistura tem compostos com ampla faixa de polaridade: o gradiente faz os compostos fracos eluir cedo e os fortemente retidos eluir quando a força eluyente aumenta, encurtando o tempo total e normalmente afinando picos (melhor sinal para compostos retidos). - Resumo prático: isocrático = simples e ótimo para poucos compostos com retenção similar; gradiente = necessário quando há compostos muito diferentes entre si para acelerar eluição e melhorar separação de compostos que, em isocrático, demorariam muito.
Passo 7
Resposta à parte (e): vantagem do detector UV por arranjo de diodos (DAD) sobre detector UV fixo
- Um detector DAD mede simultaneamente espectros UV–visíveis em várias (ou muitas) comprimentos de onda ao longo do tempo, devolvendo um espectro para cada ponto do cromatograma. Isso traz vantagens práticas:
- Possibilidade de escolher a melhor
para cada pico após a corrida; monitorização multissinal; - Verificação de pureza de pico (comparando espectros no início, topo e cauda do pico) — útil para detectar coeluições;
- Ajuda na identificação preliminar pelo formato do espectro (assinatura espectral);
- Possibilidade de escolher a melhor
- Em contraste, um detector UV fixo monitora apenas um único comprimento de onda: é mais simples e sensível naquele
, mas não permite checar pureza espectral nem ajustar posteriomente o melhor . - Em resumo: DAD = mais informação qualitativa (espectros), melhor diagnóstico de coeluição e mais flexibilidade para análise; detector fixo = mais simples e, às vezes, ligeiramente mais sensível para medições quantificativas em um
bem escolhido.
Resposta
(a) Ordem de saída (do primeiro ao último):
.\n
(b) Porque em RP-HPLC a forma neutra é mais retida; a faz com que
esteja quase todo protonado (≈99,7%, hidrofílico),
majoritariamente protonado (≈76%) e
majoritariamente neutro (≈76%, mais hidrofóbico); assim
sai primeiro, depois
, depois
.\n
(c) A eficiência de separação diminui ao aumentar o tamanho de partícula de para
; partículas maiores reduzem o número de placas
e alargam os picos (pior resolução).\n
(d) Eluição isocrática: composição da fase móvel constante durante a corrida. Eluição por gradiente: composição da fase móvel varia ao longo do tempo (normalmente aumentando a fração orgânica); o gradiente é preferido para misturas com grande variedade de polaridades porque encurta tempos e melhora picos de compostos fortemente retidos.\n
(e) Detector UV por arranjo de diodos (DAD) permite registrar espectros UV–vis tempo-resolvidos (vários simultâneos), possibilita checar pureza de pico, identificar coeluições e escolher o melhor
a posteriori; o detector UV fixo monitora apenas um comprimento de onda.
(b) Porque em RP-HPLC a forma neutra é mais retida; a
(c) A eficiência de separação diminui ao aumentar o tamanho de partícula de
(d) Eluição isocrática: composição da fase móvel constante durante a corrida. Eluição por gradiente: composição da fase móvel varia ao longo do tempo (normalmente aumentando a fração orgânica); o gradiente é preferido para misturas com grande variedade de polaridades porque encurta tempos e melhora picos de compostos fortemente retidos.\n
(e) Detector UV por arranjo de diodos (DAD) permite registrar espectros UV–vis tempo-resolvidos (vários