2- (valor 7,5 pontos) Supondo-se a análise por cromatografia liquida de alta eficiéncia de 3 compostos F, G e H cujos os pKas såo 4, 5 e 7 respectivamente. Suponha ainda que a separação tenha ocorrido mediante o uso de uma coluna de 0,46 \times 15 \mathrm{~cm}, eluida a 1,0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} a 25^{\circ} \mathrm{C} com acetonitrila 70 \% VN mais tampåo de acetato de sódio ( \mathrm{pH} 4,5 ), vazão de fase móvel 3,0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min}, fase estacionária apolar com tamanho de particula de 1,0 \mu \mathrm{~m} e detector UV do tipo arranjo de diodos. Responda os itens abaixo:
a) Sabendo-se que o composto H tem caracteristica menos hidrofóbica do que o composto G , esboce um cromatograma indicando a ordem de saida para cada analito.
b) Justifique a ordem de saida de cada composto
c) Se o tamanho da particula da fase estacionária apolar for aumentado de 1,0 para 5,0 \mu \mathrm{~m}, mantendo-se demais variáveis constantes, a eficiência de separaçåo irá aumentar ou diminuir? Justifique.
d) Explique a diferença entre eluição isocrática e eluiçâo por gradiente.
e) Qual a vantagem da deteç̧ão UV por arranjo de diodos em comparação ao detector UV fixo?

Passo 1

Primeiro vamos organizar direitinho o que o enunciado fornece (vou pegar literalmente os valores que você deu e apontar uma pequena inconsistência que aparece no texto):
  • Coluna: 0{,}46\times15\\ \mathrm{cm} (ou seja, diâmetro interno \,0{,}46\\ \mathrm{cm}=4{,}6\\ \mathrm{mm} e comprimento \,15\\ \mathrm{cm}).
  • Composição da fase móvel: 70\% (v/v) de acetonitrila + tampão acetato de sódio a \mathrm{pH}\,4{,}5.
  • Temperatura: 25^\circ\mathrm{C}.
  • Dois valores de vazão aparecem no enunciado: “eluida a 1{,}0\\ \mathrm{mL/min}” e também “vazão de fase móvel 3{,}0\\ \mathrm{mL/min}”. Há uma contradição aqui — vou escolher usar \,1{,}0\\ \mathrm{mL/min} porque é a vazão típica para uma coluna de \,4{,}6\\ \mathrm{mm} de diâmetro (explico isso brevemente mais adiante). Se a prova usar o outro valor, a ideia qualitativa das respostas não muda, apenas os tempos de retenção mudariam.
  • Fase estacionária: apolar (coluna reversa; C18 ou equivalente) com tamanho de partícula dado como \,1{,}0\\ \mu\mathrm{m} (situação inicial).
  • Detectoração: UV por arranjo de diodos (DAD).
  • pKa dos compostos: \mathrm{p}K_a(F)=4, \mathrm{p}K_a(G)=5, \mathrm{p}K_a(H)=7.
  • Informação adicional dada no enunciado: “o composto H tem característica menos hidrofóbica do que o composto G” (usar isso para orientação).
O enunciado pede os itens (a) a (e). No passo seguinte eu começo a resolver e a explicar a teoria necessária para entender cada item.

Passo 2

Primeira decisão teórica necessária (e importante para a ordem de eluição): que tipo de compostos são F,G,H?
  • Se fossem ácidos (pKa referindo-se ao ácido), então a relação ionização × pH seria diferente e a conclusão sobre hidrofobicidade poderia ficar incompatível com a frase do enunciado.
  • Como o enunciado diz explicitamente que H é menos hidrofóbico que G, isso é consistente com que esses compostos sejam bases fracas (pKs referem-se às suas bases conjugadas): para bases fracas vale que, se \mathrm{pH}<\mathrm{p}K_a, a base está majoritariamente protonada (carregada, mais hidrofílica); se \mathrm{pH}>\mathrm{p}K_a, a base está majoritariamente neutra (mais hidrofóbica).
    Portanto vou assumir que os três são bases fracas (por exemplo aminas) e que os valores de \mathrm{p}K_a são os dos seus ácidos conjugados. Essa hipótese é coerente com a informação dada sobre H e G.
Explicação curta do porquê: em cromatografia reversa (fase estacionária apolar) a espécie neutra é, em geral, mais retida (mais hidrofóbica) que a espécie carregada, que prefere ficar na fase aquosa e sai primeiro.

Passo 3

Agora uma ferramenta básica que vamos usar várias vezes: a relação de Henderson–Hasselbalch para bases (fração protonada). Para uma base fraca B com \mathrm{p}K_a do seu ácido conjugado, a fração protonada (ou seja, fração carregada \,B\!H^+) é dada por
\text{frac}_{\text{prot}}=\frac{1}{1+10^{\mathrm{pH}-\mathrm{p}K_a}}.
  • Aqui \text{frac}_{\text{prot}} é a fração da forma protonada (carregada).
  • A fração neutra é 1-\text{frac}_{\text{prot}}.
    Esses números nos dizem quão “hidrofílica” (carregada) ou “hidrofóbica” (neutra) cada composto será na condição de \mathrm{pH}=4{,}5.
Vamos calcular para cada composto, passo a passo (uso \mathrm{pH}=4{,}5):
Para H ( \mathrm{p}K_a(H)=7):
\mathrm{pH}-\mathrm{p}K_a = 4{,}5-7 = -2{,}5,\qquad 10^{-2{,}5}=0{,}003162.
\text{frac}_{\text{prot}}(H)=\frac{1}{1+0{,}003162}= \frac{1}{1{,}003162}\approx 0{,}99685\\ (\approx 99{,}7\%).
Logo a fração neutra de H é \approx 0{,}3\% — praticamente todo H está protonado (carregado) e, portanto, hidrofílico.
Para G ( \mathrm{p}K_a(G)=5):
\mathrm{pH}-\mathrm{p}K_a = 4{,}5-5 = -0{,}5,\qquad 10^{-0{,}5}=0{,}31623.
\text{frac}_{\text{prot}}(G)=\frac{1}{1+0{,}31623}=\frac{1}{1{,}31623}\approx 0{,}7597\\ (\approx 76{,}0\%).
A fração neutra de G é \approx 24{,}0\%: parte significativa está protonada (hidrofílica), parte neutra (hidrofóbica).
Para F ( \mathrm{p}K_a(F)=4):
\mathrm{pH}-\mathrm{p}K_a = 4{,}5-4 = 0{,}5,\qquad 10^{0{,}5}=3{,}1623.
\text{frac}_{\text{prot}}(F)=\frac{1}{1+3{,}1623}=\frac{1}{4{,}1623}\approx 0{,}2403\\ (\approx 24{,}0\%).
A fração neutra de F é \approx 76{,}0\% — a maior parte de F está neutra e, portanto, relativamente mais hidrofóbica.
Resumo numérico (aproximações):
  • H: \text{prot}\approx99{,}7\%, neutro \approx0{,}3\% (muito hidrofílico).
  • G: \text{prot}\approx76{,}0\%, neutro \approx24{,}0\% (intermediário).
  • F: \text{prot}\approx24{,}0\%, neutro \approx76{,}0\% (mais hidrofóbico).
Conclusão lógica: a ordem de hidrofobicidade (mais hidrofóbico → menos hidrofóbico) é
F\\ >\\ G\\ >\\ H.

Passo 4

Interpretação para cromatografia reversa (RP-HPLC):
  • Em RP-HPLC a fase estacionária é apolar; compostos mais hidrofóbicos tendem a interagir mais com a fase estacionária e, portanto, têm tempos de retenção maiores (elutam mais tarde). Compostos mais hidrofílicos preferem a fase móvel aquosa e eluem primeiro.
  • Com os números do passo anterior, F é o mais neutro (portanto o mais hidrofóbico) e ficará retido por mais tempo; G é intermediário; H é quase totalmente protonado e muito hidrofílico, sairá primeiro.
Assim a ordem de saída (do primeiro pico ao último) será:
H \quad\text{(1º)}\;, \qquad G \quad\text{(2º)}\;, \qquad F \quad\text{(3º)}.ººº
Esboço verbal do cromatograma (e o que desenhar na prova):
  • No eixo x: tempo; eixo y: sinal do detector UV.
  • Primeira subida/peak suave em tempo pequeno: H (pico com menor tempo de retenção).
  • Depois, um pico em tempo intermediário: G.
  • Por fim, um pico mais tardio e tipicamente mais largo (se houver menor eficiência) correspondente a F.
Observação: a composição da fase móvel ( 70\% acetonitrila) é relativamente forte para RP — isso tende a reduzir os tempos de retenção absolutos de todos, mas NÃO muda a ordem relativa baseada na carga/hidrofobicidade.

Passo 5

Resposta à parte (c): efeito do aumento do tamanho de partícula de \,1{,}0\\ \mu\mathrm{m} para \,5{,}0\\ \mu\mathrm{m}
  • Conceito de eficiência de coluna: costuma-se quantificar por número de placas teóricas N, com
N=\frac{L}{H},
onde L é o comprimento da coluna e H é a altura equivalente a uma placa. Uma coluna “mais eficiente” tem H menor e, portanto, N maior — picos mais estreitos e melhor resolução.
  • A dependência do tamanho de partícula com H aparece na teoria (e empiricamente): partículas menores reduzem os termos relacionados à difusão e à dispersão de caminhos (termo A de eddy diffusion) e permitem um menor H, logo maior N. De forma prática, N aumenta quando o diâmetro das partículas d_p diminui; uma regra empírica é que N é aproximadamente inversamente proporcional a d_p (ou seja, reduzir d_p aumenta bastante N).
  • Portanto, se o tamanho de partícula aumenta de \,1{,}0\\ \mu\mathrm{m} para \,5{,}0\\ \mu\mathrm{m}, a eficiência de separação diminuirá — os picos ficam mais largos, a resolução entre picos cai e fica mais difícil separar analitos próximos.
Observação prática: a vantagem de partículas maiores é menor contrapressão; vantagem de partículas menores é maior eficiência (mas com aumento da pressão). A escolha é sempre um compromisso entre eficiência e pressão/robustez.

Passo 6

Resposta à parte (d): diferença entre eluição isocrática e por gradiente
  • Eluição isocrática: a composição da fase móvel é mantida constante durante toda a corrida (por exemplo sempre 70\% acetonitrila + tampão). Simples, fácil de equilibrar a coluna, boa para misturas simples e quantificação reprodutível. Em isocrático, compostos muito retidos podem dar tempos de análise longos e picos largos.
  • Eluição por gradiente: a composição da fase móvel varia ao longo do tempo (por exemplo aumenta-se a fração orgânica de 30\% para 90\% ao longo de vários minutos). Muito útil quando a mistura tem compostos com ampla faixa de polaridade: o gradiente faz os compostos fracos eluir cedo e os fortemente retidos eluir quando a força eluyente aumenta, encurtando o tempo total e normalmente afinando picos (melhor sinal para compostos retidos).
  • Resumo prático: isocrático = simples e ótimo para poucos compostos com retenção similar; gradiente = necessário quando há compostos muito diferentes entre si para acelerar eluição e melhorar separação de compostos que, em isocrático, demorariam muito.

Passo 7

Resposta à parte (e): vantagem do detector UV por arranjo de diodos (DAD) sobre detector UV fixo
  • Um detector DAD mede simultaneamente espectros UV–visíveis em várias (ou muitas) comprimentos de onda ao longo do tempo, devolvendo um espectro para cada ponto do cromatograma. Isso traz vantagens práticas:
    • Possibilidade de escolher a melhor \lambda para cada pico após a corrida; monitorização multissinal;
    • Verificação de pureza de pico (comparando espectros no início, topo e cauda do pico) — útil para detectar coeluições;
    • Ajuda na identificação preliminar pelo formato do espectro (assinatura espectral);
  • Em contraste, um detector UV fixo monitora apenas um único comprimento de onda: é mais simples e sensível naquele \lambda, mas não permite checar pureza espectral nem ajustar posteriomente o melhor \lambda.
  • Em resumo: DAD = mais informação qualitativa (espectros), melhor diagnóstico de coeluição e mais flexibilidade para análise; detector fixo = mais simples e, às vezes, ligeiramente mais sensível para medições quantificativas em um \lambda bem escolhido.

Resposta

(a) Ordem de saída (do primeiro ao último): H,\\ G,\\ F.\n
(b) Porque em RP-HPLC a forma neutra é mais retida; a \mathrm{pH}=4{,}5 faz com que H esteja quase todo protonado (≈99,7%, hidrofílico), G majoritariamente protonado (≈76%) e F majoritariamente neutro (≈76%, mais hidrofóbico); assim H sai primeiro, depois G, depois F.\n
(c) A eficiência de separação diminui ao aumentar o tamanho de partícula de 1{,}0\\ \mu\mathrm{m} para 5{,}0\\ \mu\mathrm{m}; partículas maiores reduzem o número de placas N e alargam os picos (pior resolução).\n
(d) Eluição isocrática: composição da fase móvel constante durante a corrida. Eluição por gradiente: composição da fase móvel varia ao longo do tempo (normalmente aumentando a fração orgânica); o gradiente é preferido para misturas com grande variedade de polaridades porque encurta tempos e melhora picos de compostos fortemente retidos.\n
(e) Detector UV por arranjo de diodos (DAD) permite registrar espectros UV–vis tempo-resolvidos (vários \lambda simultâneos), possibilita checar pureza de pico, identificar coeluições e escolher o melhor \lambda a posteriori; o detector UV fixo monitora apenas um comprimento de onda.

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